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革蘭氏染色

[ 更新時(shí)間(jiān)：2014-06-09 ]
革蘭氏染色

編輯

 
革蘭氏染色法是(shì)細菌學中廣泛使用(yòng)的(de)一(yī)種鑒别染色法，1884年♦♠(nián)由丹麥醫(yī)師(shī)Gram創立。未經染色之細♠ε€₽菌，由于其與周圍環境折光(guāng)率差别甚小(xiǎo)，故在顯微(♠←♠wēi)鏡下(xià)極難觀察。染色後細♦φ 菌與環境形成鮮明(míng)對(duì)比，可(kě)以清楚地(dì)觀察到(dào)細菌的(∏™>↓de)形态、排列及某些(xiē)結構特征，而用(yòng)以&≈β分(fēn)類鑒定。革蘭氏染色屬複染法。★♣"

中文(wén)名
革蘭氏染色
所屬學科(kē)
細菌學
發明(míng)時(shí)間(jiān)
1884年(nián)
發明(míng)人(rén)
漢斯·克裡(lǐ)斯蒂安·革蘭®₹α
結    果
呈紫色，呈紅(hóng)色
是(shì)否有(yǒu)誤差
是(shì)

1方法簡介編輯

是(shì)細菌學中廣泛使用(yòng)$‍≈的(de)一(yī)種鑒别染色法，這(zhè)種染色法是(δφshì)由一(yī)位丹麥醫(yī)生(shēng)漢斯·克裡(lǐ)斯蒂安·革蘭（Hans Christian Gram，1853年(nián)－1938年(nián)）于18↓✘84年(nián)所發明(míng)，最初是(shì)用(yòng)來(lá$↕i)鑒别肺炎球菌與克雷白(bái)氏肺炎菌之間(jiān)的(↑​de)關系。
未經染色之細菌，由于其與周圍環境折光(guāng)率差别甚小(xiǎo)©∞♠β，故在顯微(wēi)鏡下(xià)極難觀察
陽性紫色陰性紅(hóng)色

  陽性紫色陰性紅(hóng)色

。染色後細菌與環境形成鮮明(míng)對(duì)比，可(kě)以清楚≈δ→地(dì)觀察到(dào)細菌的(de)形态、排列及某些(xiē)結構特征，而用(yòng)以分€"(fēn)類鑒定。
相(xiàng)關選擇
緻病菌與抗菌藥選擇
革蘭氏陽性菌：葡萄球菌屬（主要(yào)是(shì)金(jīn)黃(huáng)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、鏈球菌屬（肺炎鏈球菌、草(cǎo)綠(lǜ)色鏈球菌、腸球菌 ↔™等）、白(bái)喉杆菌、炭疽杆菌、破傷風(fēng)杆菌、蠟樣芽孢杆菌等，其中，金(jīn)黃(huáng)色葡萄球菌、腸球菌等為(wèi)臨床重要(yào)等病原菌。
革蘭氏陽性菌通(tōng)常對(duì)青黴素類、第一(yī)（或第二）代頭孢菌素、萬古黴素、克林(lín)黴素等高(gāo)度敏感，但(dàn)是(shì)因為(wèi)抗生(shēn∏≤g)素的(de)濫用(yòng)，MRSA/MRSE、VRSA/VISA、PISP/PRSP、VRE等多(duō)重耐藥γ§Ω菌已經嚴重威脅著(zhe)人(rén)類的(de)生(shēng)命÷Ω，這(zhè)些(xiē)細菌感染時(shí)，φ¥可(kě)以考慮使用(yòng)萬古黴素、共殺素（奎奴普丁/達福普丁）、利奈唑胺、達托黴素、泰利黴素、夫西(xī)地(dì)酸（建議(yì)與耐酶的(de)∞•青黴素類或利福平聯用(yòng)）等。另外(wài)，CNS（凝固酶陰性葡萄球菌）等細菌也(yě)要(yào)引起足夠等重視(shì¶π)。
革蘭氏陰性菌：埃希氏菌屬、枸橼酸菌屬、假單胞菌屬（綠(lǜ)膿杆菌等）、莫拉菌屬（卡他(tā)莫拉菌等）、奈瑟菌屬（淋球菌、腦(nǎo)膜炎雙球菌等）、不(bù)動杆菌屬（鮑曼不(bù)動杆菌、羅菲不(bù)動杆菌等）、克雷伯菌屬（主要(yào)是←×  (shì)肺炎克雷伯杆菌）、沙門(mén)氏菌屬、志(zhì)賀氏菌屬（痢疾杆菌等）、黃(huáng)杆菌屬、變形杆菌屬、軍團菌屬、耶爾森(sēn)菌屬、嗜NDM-1血杆菌屬（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、産氣杆菌屬、霍亂弧菌、陰溝腸杆菌等。革蘭氏陰性菌在院內(nèi)感染中的(de)細☆↔菌感染中占了(le)大(dà)約65%，且大(dà)多(duō)菌株容易π§對(duì)抗菌藥物(wù)耐藥，産生(shēng)“新德裡(lǐ→α®)金(jīn)屬酶”（）的(deελ ​)絕大(dà)多(duō)數(shù)細菌都(dōu)是(shì)革蘭氏陰性菌（主要(y∞≤εào)是(shì)大(dà)腸杆菌、鮑曼不(bù)動杆菌和(hé)肺炎克雷伯杆菌）。
革蘭氏陰性菌對(duì)第三代頭孢菌素（頭孢他(tā)啶、頭孢噻肟、頭孢曲松等）、氨基糖苷類（慶大(dà)黴素、妥布黴素等）、抗假單胞菌屬的(de)青黴素類（哌拉西(xī)林(lín)、替卡西(xī)林(lín)、羧苄西(xī)林(lín)等）、多(duō)粘菌素等高(gāo)度敏感，對(duì™≤€)頭黴素類和(hé)第二代頭孢菌素也(yě)較敏感，但(dàn)是(shì)，MDR≥∑♠-AB/PDR-AB、PDR-PA等多(duō)重耐藥菌給臨床用(yòng)藥帶來(lái)過♠ε∑∑很(hěn)大(dà)的(de)困難。多(duō)粘菌素、碳青黴烯類（亞胺培南(nán)、美(měi)羅培南(nán)等）、替加環素等可(kě)以用(yòng)于多(duō)重耐藥菌等治療，但(dàn)要(yào)慎用(yòng)Ωπ，否則很(hěn)可(kě)能(néng)會(huì)到(dà←★o)無藥可(kě)醫(yī)的(de)地(dì)步（綠(lǜ)膿杆菌和(hé<✘↓)鮑曼不(bù)動杆菌的(de)一(yī)些(xiē)菌株甚至已經± &對(duì)碳青黴烯類有(yǒu)耐藥性）。值得(de)注≠λ✘意的(de)是(shì)，頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西(xī)林(lín)/他(tā)唑巴坦、替卡西(xī)林(lín)/克拉維酸、氧頭∏&孢烯類（拉氧頭孢、氟氧頭孢等）對(duì)某些(xiē)多(duō)重耐藥菌也(yě)∏®有(yǒu)特效，比如(rú)産ESBLs或AmpC酶的(de)菌株，可(kě)以考慮與其他(tā)抗菌藥物 α≥¥(wù)（磷黴素等）聯用(yòng)，另外(wài)，多(duō)西(xī)環素和(hé)多(duō)粘菌素聯用(yòng)時(shí)，幾乎對(duì)所有(yǒ&✘©∏u)對(duì)細菌都(dōu)有(yǒu)協同抗菌∞​±作(zuò)用(yòng)，也(yě)可(kě)考慮。
根據細菌的(de)革蘭氏染色性質，可(kě)以縮小(xiǎo)鑒定範圍，有(yǒu)≥•$↓利于進一(yī)步分(fēn)離(lí)鑒定，以對(duì)疾病做(zuò)出診斷。又(yòu)♦≈∞由于各種抗生(shēng)素的(de)抗菌譜不(bù)同，革↔≠↔$蘭氏染色尚可(kě)做(zuò)為(wèi)選用(yò•♠¥ng)抗生(shēng)素的(de)參考。

2實驗方法編輯

步驟

革蘭氏染色法一(yī)般包括初染、媒染、脫色、複染等四個(gè)<♣¶ 步驟，具體(tǐ)操作(zuò)方法是(shì)：
1）塗片固定。
2）草(cǎo)酸铵結晶紫染1分(fēn)鐘(zhōng)。
3）自(zì)來(lái)水(shuǐ)沖洗。
4）加碘液覆蓋塗面染約1分(fēn)鐘(zhōng)。
5）水(shuǐ)洗，用(yòng)吸水(shuǐ)紙(zhǐ)吸去(qù)水(sh§≈uǐ)分(fēn)。
6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行(xíng)脫色，20秒(miǎo)後∞β∑水(shuǐ)洗，吸去(qù)水(shuǐ)分(fēn)。
7）蕃紅(hóng)染色液（稀）染1分(fēn)鐘(₽>•zhōng)後，自(zì)來(lái)水"♠>'(shuǐ)沖洗。幹燥，鏡檢。

原理(lǐ)

通(tōng)過結晶紫初染和(hé)碘液媒染後，在細胞壁內(nèi)形成了(le)不(bù)溶于水₽<(shuǐ)的(de)結晶紫與碘的(de)複合物(wù)，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁♦ 較厚、肽聚糖網層次較多(duō)且交聯緻密，故遇乙醇或丙酮脫色處理(lǐ)時(shí)，因失水(sγ≤φ↑huǐ)反而使網孔縮小(xiǎo)，再加上(shàng)它不(bù)含類脂，故乙醇處理(lǐ)δαπ不(bù)會(huì)出現(xiàn)縫隙，，因此能(néng)把結晶紫與碘複合物(wù)牢牢留• ×在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰 × ​性菌因其細胞壁薄、外(wài)膜層類脂含量高(gāo)、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後☆≥∏∞，以類脂為(wèi)主的(de)外(wài)膜迅速溶δ 解，薄而松散的(de)肽聚糖網不(bù)能γ¥​•(néng)阻擋結晶紫與碘複合物(wù)的(de)溶§↕出，因此通(tōng)過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃(huáng)等紅(hóng)色✔↔染料複染，就(jiù)使革蘭氏陰性菌呈紅(hóng)色。
染色的(de)差異主要(yào)是(shì)由于陰性與陽性細菌細胞壁的(de)差異所引起的(de)。
①革蘭氏陽性細菌的(de)細胞壁
G+細菌細胞壁具有(yǒu)較厚（20-80nm）而緻密的(de)肽聚β¶♠‌糖層，多(duō)達50層，占細胞壁成分(¶∑♠fēn)的(de)40%～95%，它同細胞膜的(de)外(wài)層緊密相(α±✔•xiàng)連（圖2-9）。有(yǒu)的(de)G+細菌細胞壁中含有(yǒu)磷壁酸（t✘$∞≤eichoic-acid），也(yě)稱胞壁質（murein），它是(s​&ε∞hì)甘油和(hé)核糖醇的(de)聚合物(wù)，磷 ≤壁酸通(tōng)常以糖或氨基酸的(de)酯而存在。由于磷壁酸帶負電(diàn)荷，它在細胞表面能 €(néng)調節陽離(lí)子(zǐ)濃度。磷壁酸與細胞生(shēng)長( π≥¶cháng)有(yǒu)關，細胞生(shēng)長(cháng)中有(yǒu)自(zì)溶§ε§素（autolysins）酶類起作(zuò)用± (yòng)，磷壁酸對(duì)自(zì)溶素有(yǒu)調節功能(nén$‌g)，阻止胞壁過度降解和(hé)壁溶。
如(rú)果細胞壁的(de)肽聚糖層被消溶，G+細胞成為(wèi)原生(shēng)質₩★₽₹體(tǐ)（protoplasts），細胞壁不(bù)複存在，而隻存留細胞膜。除鏈↕Ω 球菌外(wài)，大(dà)多(duō)數(shù)G+細菌細胞壁中含極少(s<£ hǎo)蛋白(bái)質。
②革蘭氏陰性細菌的(de)細胞壁 G—細菌細胞壁比G+細''菌細胞壁薄（15～20nm）而結構較複雜(zá)，分(fπ←$ēn)外(wài)膜（outer membrane）和(♣&→hé)肽聚糖層（2～3nm）（圖2-10）。在細胞壁和(hé)細胞質膜之間(jiānΩ₩™)有(yǒu)一(yī)個(gè)明(míng)顯的(de)空(kōng)間(jiān)，稱為(☆✘™wèi)壁膜間(jiān)隙（periplasmic space）。₽φ££
外(wài)膜 G—細菌細胞壁外(wài)膜的(¶→de)基本成分(fēn)是(shì)脂多(d♣ ↕uō)糖（lipopolysaccharide,LPS），它同σπ'細胞質膜相(xiàng)同之處也(yě)是♣∞§(shì)雙層類脂，但(dàn)除磷脂外(wài)還(hái)含有(yǒu)§♣ 多(duō)糖和(hé)蛋白(bái)質。
LPS的(de)多(duō)糖部分(fēn)包括核心多(duō)糖和(₩∑hé)O-特異多(duō)糖。O-特異多(duō)糖由重複分(fēn)支的(de)碳水(shuǐ)化(huà)合物(wù)分(fēn)子(zǐ)組ε & 成，含有(yǒu)已糖（葡萄糖、半乳糖和(hé)鼠李糖）和(hé)二脫氧已糖。由于糖✔ ✘的(de)種類不(bù)同，使各種G—細胞具有(yǒu)↓Ω不(bù)同特性的(de)LPS。核心多(duō)糖（core polysa↔↑✘ccharide）的(de)主要(yào)組分(fē ‍n)是(shì)酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外(wài)膜中還(hái)含有(yǒu)幾∏•種蛋白(bái)，如(rú)脂蛋白(bái)、通(tσ£ōng)透蛋白(bái)。有(yǒu)些(xiē↕₩↕×)蛋白(bái)具有(yǒu)通(tōng)孔作(zuò)用(yòng)（$ porin），調控外(wài)界分(fēn)子(zǐ)進入細胞；有(yǒu)的(de)​§€蛋白(bái)分(fēn)子(zǐ)可(kě)以作(zuò)為(wèi)噬菌體(tǐ)的$​(de)受體(tǐ)；許多(duō)G&£φα♦mdash;細菌對(duì)高(gāo)等生(shēng)物(wù)有(yǒu)緻病性是(s™✔☆¶hì)由LPS的(de)成分(fēn)決定的(de) >α★，它的(de)毒性組分(fēn)常稱為(wèi)內(nèi)毒素（endotoxins）。
肽聚糖層 G—細菌細胞壁的(de)肽聚糖層很(hěn)薄，在大(dà)腸杆菌和(h₽'é)其它細菌中僅有(yǒu)單
層。肽聚糖層和(hé)外(wài)膜的(de)內(nèi)層之間(jiān)π✘通(tōng)過脂蛋白(bái)連接起來(lái)。
壁膜間(jiān)隙 G—細菌細胞壁的(de)外(wài)膜與細胞質膜之∑∏<間(jiān)存在明(míng)顯的(de)壁✘>δ膜間(jiān)隙，一(yī)層薄的(de)肽聚糖處于其間(jiān)，肽聚糖層和(hΩ♠é)細胞質膜之間(jiān)的(de)間(jiān)隙較寬，肽聚糖層至外(wài)膜•™之間(jiān)的(de)間(jiān)隙較窄。大(≥ dà)腸杆菌的(de)壁膜間(jiān)隙寬度為(wèi)12～15nm，呈膠胨态。其¶ε間(jiān)含有(yǒu)三類蛋白(bái)質：水(shuǐ)解酶，催化(huà)食物‌λδ(wù)的(de)初步降解；結合蛋白(bái)，啓動物(wù)質轉運過程；化>↔(huà)學受體(tǐ)（chemoreceptors），在趨化(huà)性中起作( β∏₹zuò)用(yòng)的(de)蛋白(bái)。

染色結果

革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅(hóng∏∞≈∞)色。

3臨床意義編輯

其重要(yào)的(de)臨床意義在于：1.鑒别細菌 2.選擇藥物(wù) ≤ε3.與緻病性有(yǒu)關：革蘭氏陽性菌能(néng)産生(shēng)外(wài)毒素，革蘭氏陰'☆→•性菌能(néng)産生(shēng)內(nèi)毒素；而內(n‍®φèi)毒素主要(yào)是(shì)指革蘭氏陰性菌胞壁成分(f•↔εēn)中的(de)脂多(duō)糖，兩者的(de)緻病作(zuò)用(y"​>✔òng)不(bù)同。

4特性編輯

革蘭氏染色屬複染法，即将标本固定後，先用(yòng)龍膽紫染色，加碘液媒染後用(yòng)酒精脫色，再用(yòng)蕃紅(hóng)複染。染色後除可(kě)以看(kàn±≈ ')到(dào)細菌形态外(wài)，還(hπ↓ái)可(kě)将細菌分(fēn)為(wèi)兩大(dà)類，即不(bù)被酒精脫色而保留紫色者≈← 為(wèi)革蘭氏陽性菌（G+）。被酒精脫色複染成紅(hóng)色者為(wèi)革蘭氏陰性菌（G-）。革蘭氏染色原理(lǐ)尚不(bù)肯定，可(kě)能(néng)與細菌所帶核糖核酸、細Ω✔$↕菌壁結構通(tōng)透性、等電(diàn)點等因素有↔φ(yǒu)關。緻病菌如(rú)金(jīn)黃(h↑‌‌∞uáng)色葡萄球菌、綠(lǜ)色溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白(bái)喉杆菌、碳疽杆菌等屬革蘭氏染色陽性菌。百日(rì)咳杆菌、大(dà)腸杆菌、傷寒杆菌、痢疾杆菌、霍&>€Ω亂弧菌、流行(xíng)性腦(nǎo)膜炎雙球菌、淋病雙球菌等均屬革蘭∞≠ σ氏陰性。

5鑒定原理(lǐ)編輯

革蘭氏染色

  革蘭氏染色

該染色法所以能(néng)将細菌分(fēn)為(wèi)G+菌和(hé)G-菌，是(shì)§α由這(zhè)兩類菌的(de)細胞壁結構和(hé)成分(fēn)的(de)不(bù)同所決定的(de)。G-菌的(de)細胞§€壁中含有(yǒu)較多(duō)易被乙醇溶解的(de)類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低(dī)，£↔γ故用(yòng)乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了(le)類脂質，增加了(le₩•)細胞壁的(de)通(tōng)透性，使初染§λ↔α的(de)結晶紫和(hé)碘的(de)複合物(wù)易于滲出，​©結果細菌就(jiù)被脫色，再經蕃紅(hóng)複染後就(jiù)成紅(hón₽λε¶g)色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高(gāo)，類脂質含量少(shǎo)，♣β®÷經脫色劑處理(lǐ)後反而使肽聚糖層的(de)孔徑縮小(x♣→≥≤iǎo)，通(tōng)透性降低(dī)，因此細菌仍保留初染時(shí)的(de)顔色，呈現(xiàn)藍(láβ₽n)紫色。

 

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