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層析

[ 更新時(shí)間(jiān)：2014-06-18 ]

層析★ε£✘（chromatography）是(shì)“色♣☆層分(fēn)析”的(de)簡稱。利用(yòng)各組€£分(fēn)物(wù)理(lǐ)性質的(de)不(bù)同，将多¶↑ (duō)組分(fēn)混合物(wù)進行(xíng)分(fēn)離(lí)及測定的(de)方法。有(yǒu)吸附層析、分(fēn)配層析兩種。一(yī)般用(yòng)于有(yǒu)機(jī)化(huà)合物(wù)、金(jīn)屬離(lí)子(zǐ)、氨基酸等的(de)分(fēn)析。層析利用(yòng)物(wù)質在固定相(xiàng)與流動相(xiàng)之間(jiān)不(bù)同的(de)分(fēn)配比例，達到(dào)分(f♣≤±←ēn)離(lí)目的(de)的(de)技(jì)術(shù)。層析對(duì)生(shēng)物(wù)大(dà)分(fēn)子(zǐ)如(rú)蛋白(bái)質和(hé)核酸等複雜(zá)的(de)有(yǒu)機(jī)物(>¶wù)的(de)混合物(wù)的(de)分(fēn)離(lí)分(fēn)析有(>✘↑yǒu)極高(gāo)的(de)分(fēn)辨力。

1語源學編輯

chroma意為(wèi)“色彩&rdqu≠©o;，graphy源自(zì)希臘文(wén)，意為(wèi)“寫&rdquoγ÷;。色譜為(wèi)層析的(de)同義語，都(dōu)是(shì)從(cóng)英語c∞π≤•hromatography譯來(lái)

的(de)。

層析（色譜） chromatography

在把微(wēi)細分(fēn)散的(de)固體(tǐ)或是(shì)附著(zhe)于固體(tǐ)表面的(de)液體(tǐ)作(zuò)為(wèi)固定相(xiàng)，把液體(tǐ)（與上(shàng)述液體(tǐ)不(bù)相(x'♣iàng)混合的(de)）或氣體(tǐ)作(zuò)為(wèi)移動相(xiàn₽≥↑g)的(de)系統中，使試料混合物(wù)中的(de)各成分(fēn)邊保持向兩相(xiàng∞‌↕♠)分(fēn)布的(de)平衡狀态邊移動，利用(yòng)各成分(fēn)對(duì)固定相(xiàng)βσφ親和(hé)力不(bù)同所引起的(de)移動速度差，将它們彼此分(fēn)離(lí)✘€♠ 開(kāi)的(de)定性與定量分(fēn)析方法，稱為(wèi)層析，亦稱色譜法。根據移動相(xiàng)種類的(de)不(bù)同，分(f<✔≥←ēn)為(wèi)液體(tǐ)層析、氣體(tǐ)層析二種。用(yòng)作(zuò) ≥固定相(xiàng)的(de)有(yǒu)矽膠、活性炭、氧化(huà)鋁、離(lí)子(zǐ)交換樹(shù)脂、離(lí)子(zǐ)交換纖維等，或是(shì)在矽藻土(€Ωλtǔ)和(hé)纖維素那(nà)樣的(de)無活性的(de)載體(tǐ)上(shàng)附著(♣↔>λzhe)适當的(de)液體(tǐ)，也(yě)可(kě)使用(yòng)其他(tā)物(wù)質。÷ 将作(zuò)為(wèi)固定相(xiàng)的(de)微(wēi)細粉末狀物(wù)質裝入細長(cháng)形圓筒中進行(‌→xíng)的(de)層析稱為(wèi)柱層析（column chromatogra-phy），在玻璃闆上(shàng)塗上(shàng)一(yī)層薄而均的(de)物(wù)質 "作(zuò)為(wèi)固定相(xiàng)的(de)稱為(wèi)薄層 <層析（thin-layer chromato↔×graphy），後者可(kě)與用(yòng)濾紙(zhǐ)作(zuò)為(wèi)固定相(xiàng)的(de)紙(zhǐ)上(shàng)層析進行(xíng)同樣的(de)分(fēn)析，即在固定相(xi♠★àng)的(de)一(yī)端，點上(shàng)微(wēi)量試料，在∑≤♥密閉容器(qì)中，使移動相(xiàng)（液體(tβ×™ǐ)）從(cóng)此端滲入，移動接近(jìn)另一→¶γ©(yī)端。通(tōng)過這(zhè)種展開(kāi)操作(zu✘∏ò)，各成分(fēn)呈斑點狀移動到(dλ✘εεào)各自(zì)的(de)位置上(shàng)，再根據Rf≥βλ值的(de)測定進行(xíng)鑒定。當斑點不(bù)易為(wèi)肉眼觀察時(shí)β€♥↔，可(kě)利用(yòng)适當的(de)顯色劑，或通(tōng)過紫外(wài)燈下(λxià)産生(shēng)熒光(guāng)的(de)方法進行(xíng)觀察。也(yě)可(kě)采用(yòn₩₽g)在第一(yī)種移動相(xiàng)展開(kāi)後再用(yòng)另一(yī)移動相★₩(xiàng)進行(xíng)展開(kāi)（這(zhè)時(shφ≈♠í)的(de)展開(kāi)方向應與原方向垂直），使各成分(fēn→♣)分(fēn)離(lí)完全的(de)雙向層析（two-di∞'÷mensional chromatography）。分(fēn)離(lí)後，将斑λφ♣↕點位置的(de)固定相(xiàng)切取下(xià)來(lái)，把其中含有(yǒu)來(lái)自(zδ↕<€ì)試料的(de)物(wù)質提取進行(xíng)定量分(fēn)析。但(dàn™↔×)為(wèi)制(zhì)備與定量，柱層析則更為(wèi)适宜。在柱層析中，移動相(xiàng)從(cóng)加入試料的(de)一(yī)端展開(k∑∏‌āi)到(dào)達另一(yī)端後，繼± ‌‍續展開(kāi)使各成分(fēn)和(hé)移動相(xiàng)一(yī)&•起向柱外(wài)分(fēn)别溶出，這(zhè)就(jiù)是(shì)廣泛使用(yòng<±♥)的(de)所謂洗提層析（elution chromatography）。層析根據¶γ≈固定相(xiàng)與溶質（試料）間(jiān)親和(hé)力的(de)差異分(fēn)為(wèi)吸附型、分(fēn)配σ"λ≈型、離(lí)子(zǐ)交換型（離(lí)子(zǐ)交換層析）等三種類型。但(dàn)這(zhè)并不(bù)是(σ✘δ✘shì)很(hěn)嚴格的(de)，有(yǒ≤ ∞u)時(shí)常見(jiàn)到(dào)其中間(jiān)類型。此外(wà≠Ωi)，近(jìn)來(lái)也(yě)應用(yòng)親和(hé)層析，即将與基質類似的(de)化(huà)合物(wù)（通(tōng)常為(wèi)共價鍵）結合到(dào)固定相(xiàng)上(shàng)，再利用(yòng)其特異的(₹φde)親和(hé)性沉澱與其對(duì)應的(de)特定的(de)酶或蛋白(bái)質。

2類别編輯

◆按層析的(de)機(jī)理(lǐ)劃分(fēn)：

吸附層析、分(fēn)配層析、離(lí)子(zǐ)交換層析、凝膠過濾層析、親和(hé)層析等。

吸附層析：利用(yòng)吸附劑表面對(duì)δ$ 不(bù)同組分(fēn)吸附性能(né©≤ng)的(de)差異，達到(dào)分(fēn)離(lí)鑒定的(de)目♣$的(de)。

分(fēn)配層析：利用(yòng)不(bù)同組分(fēn)在流動相(xiàng)和(hé)固定相(xiàng)之間(jiān)的(de)分(fēn)配系數(shù)不(bù)同，使之分(fēn)離(lí)。

離(lí)子(zǐ)交換層析：利用(yòng)不(bù)同組分(fēn§γ↔)對(duì)離(lí)子(zǐ)交換劑親和(hé)力的(de)不(bù)同。

凝膠層析：利用(yòng)某些(xiē)凝膠對(duì)于不(bù)同分(fēn)子(zǐ)大(λ>dà)小(xiǎo)的(de)組分(fēn)阻★£↑↔滞作(zuò)用(yòng)的(de)不(bù)同。

◆按流動相(xiàng)與固定相(xiàng)的(de)不(bù)同劃分(fēn)：

氣相(xiàng)層析、液相(xiàng)層析。這(zhè)兩大(dà)類層析是(shì)以‌≥₽流動相(xiàng)不(bù)同來(lái)劃分(fēn)的(de)✘£。如(rú)同時(shí)區(qū)分(fēn)流動相(xiàng)和(hé)固定相(xiàng)，劃分(fēn)為(wèi)：氣固層析、氣液層析、液固層析和(hé)液液層析等。

◆按操作(zuò)形式劃分(fēn)：

柱層析、紙(zhǐ)層析、薄層層析、高(gāo)效液相(xiàng)層析等。

柱層析：将固定相(xiàng)裝于柱內(nèi)，使樣品沿一(yī)個(gè)方向移動而達到(dà∏‌o)分(fēn)離(lí)。

紙(zhǐ)層析：用(yòng)濾紙(zhǐ)做(zuò)液體(tǐ)的(de)載體(tǐ)，點樣後，用(yòng)流動相(xiàng)展開(kāi)，以達到(dào)分(fēn)離(lí)鑒定的(de)目的(de)。

薄層層析：将适當粒度的(de)吸附劑鋪成薄層，以紙(zhǐ)層析類似的(♣≥✔→de)方法進行(xíng)物(wù)質的(de)分(fēn)✘♦€離(lí)和(hé)鑒定。

以上(shàng)劃分(fēn)無嚴格界限，有(yǒu)些(xi‌ε≠←ē)名稱相(xiàng)互交叉，如(rú)親和(hé)層析應屬于一(yī)種特殊的(de)吸附層析，紙(zhǐ)層析是(shì)一(yī)種分(fēn)配層析，柱層析可(kě)做(zuò)各種層析。

3基本原理(lǐ)編輯

層析須在兩相(xiàng)系統間(jiān)進行(xíng)。一(yī) ₽≤相(xiàng)是(shì)固定相(xiàng)，需支持物(wù)，是(shì)固體(tǐ)或液體(tǐ)。另一(yī)相(xiàng♠♠∏≠)為(wèi)流動相(xiàng)，是(shì)液體(tǐ)或氣體(tǐ)。當流動相(xiàng)流經固定相(xiàng)時(shí)，被分(fēn)離(lí)物(wù)‌¥質在兩相(xiàng)間(jiān)的(de)分(fēn)配，由平衡狀态到(dào)失去(qù)平衡到(dào)♣≈φ又(yòu)恢複平衡，即不(bù)斷經曆吸附和(h₽±εé)解吸的(de)過程。随著(zhe)流動相(xiàng)不(bù)斷向前流動，被分(fēn)離(lí)物(wù)質間(jiān)出現(xiàn)向前移動的&↑(de)速率差異，由開(kāi)始的(de)單一(yī)區(qū)帶逐漸分(fēnσ¶$)離(lí)出許多(duō)區(qū)帶，這(zhè)個(gè)過 '®程叫展層。

系數(shù)K是(shì)物(wù)質在兩相(xiàng§₩)中的(de)濃度比。K值大(dà)，則在固定相(xiàng)中吸附牢，K值小(xiǎo)吸附差。各物(wù)質間(jiān)的(de)K值差别大(dà)，‍®則易被分(fēn)離(lí)。不(bù)同類型層析的(de)K值含義不(bù)同，可¶"(kě)視(shì)為(wèi)吸附平衡常數(shù)，分(fēn)配常數(shù)或離(lí)子(zǐ)交換常數(shù)等。

研究層析現(xiàn)象而發展的(de)塔闆理(lǐ)論，與有(yǒu)機(jī)化(huà)學實驗中的(de)分(fēn)餾法原理(lǐ)有(yǒu)些(xiē)相(xiàng)似。被分(fēn)¥∏≥餾的(de)有(yǒu)機(jī)溶劑在分(fēn)餾柱內(nèi)的(de)填充物(wù)上(shàng)形成許<≈多(duō)熱(rè)交換層，從(cóng)而把低(dī)沸點溶劑先分(fēn π®)餾出來(lái)，達到(dào)純化(huà)的(de)目的(de≥>φ)。在層析時(shí)用(yòng)理(lǐ)論塔闆數(shù)n來(lái)衡量層析效能(néng)。

tR為(wèi)物(wù)質在層析柱上(shàng)的(de)保留時(shí)間(jiān)，W為($φ♠wèi)洗脫下(xià)來(lái)的(de)物(wù)質峰形的(de)寬度δ₩★。n值愈大(dà)表示層析柱的(de)效能(néng)愈高(gāo)。如(rú)用(yòng)理(lǐ)論塔闆高(gāo)度H表示，則包含了(le)層析柱長(cháng)度的(de)因子(zǐ)。≠★

式中L為(wèi)層析柱的(de)柱長(cháng)。H值越大(dà)，則柱效越低(dī)。

此外(wài)影(yǐng)響層析分(fēn)離(lí)效果的(de)還(hái)有(yǒ<®u)渦流擴散、縱向擴散和(hé)傳質阻抗等因素。因此選擇層析固定相(xiàng)支持物(wù)的(de)粒度、均勻度等物(wù)理(lǐ©)性能(néng)，流動相(xiàng)的(de)層析系統和(hé)溫度等都(dōu)是(shì)做(zuò)好(hǎ✘γ&∏o)層析的(de)關鍵。

4常用(yòng)層析編輯

◆吸附層析

吸附劑的(de)吸附力強弱，是(shì)由能(néng)否有(yǒu)效地(dì)接受或&π÷供給電(diàn)子(zǐ)，或提供和(hé)接受活潑氫來(lái)決定。被吸附物(wù)的(de♥ )化(huà)學結構如(rú)與吸附劑有(yǒu)相(xiàng)似的(de)電(diàn)子(zǐ)特性，吸附就(jiù)更牢固。常用(yòng♥π☆)吸附劑的(de)吸附力的(de)強弱順序為(wèi)：活性炭、氧化(huà)鋁、矽膠、氧化(huà)鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、澱粉和(hé)糖等。以活性炭的(de)吸附力最強。吸附劑在使用(yòng)前須先用(yòng)加熱(rè)脫水(shu•‌ǐ)等方法活化(huà)。大(dà)多(duō)數(shù)吸附劑遇÷•₹水(shuǐ)即鈍化(huà)，因此吸附層析大(dà)多(duō)用(yòng)于能(néng)溶于有(yǒu)機(jī)溶劑的(de)有(yǒu)機(jī)化(huà)合物(wù)的(de)分(fēn)離(lí)，較少(shǎo)用(yòng)于無機(↑✔jī)化(huà)合物(wù)。洗脫溶劑的(de)解析能(néng)力的(de)強弱順序是(shì)：醋酸、水(shuǐ)、•±✔€甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化(huà)碳和(hé)己烷等。為(wèi)了(le)能(néng)得(de)到(dπ'₽¥ào)較好(hǎo)的(de)分(fēn)離(lí)效果，常用(yòng)兩種或數(&↕shù)種不(bù)同強度的(de)溶劑按一(yī)定比例混合，得(de)到(dà✔♠↑o)合适洗脫能(néng)力的(de)溶劑系₩∏'統，以獲得(de)最佳分(fēn)離(lí)效果。

◆分(fēn)配層析

在支持物(wù)上(shàng)形成部分(fēn)互溶的(de)兩相(xiàngΩ&↕∏)系統。一(yī)般是(shì)水(shuǐ)相(xiàng)和(hé)有(yǒu)機(jī)溶劑相(xiàng)。 ∑×♠常用(yòng)支持物(wù)是(shì)矽膠、纖維素和(hé)澱粉等，這(zh★≈≤è)些(xiē)親水(shuǐ)物(wù)質能(‌←néng)儲留相(xiàng)當量的(de)水(shuǐ)。被分(fēn)☆ 離(lí)物(wù)質在兩相(xiàng)中都(dōu)能(néng<↕♠÷)溶解，但(dàn)分(fēn)配比率不(bù)同>¥&，展層時(shí)就(jiù)會(huì±$)形成以不(bù)同速度向前移動的(de)區(qū)α"帶。

◆離(lí)子(zǐ)交換層析

支持物(wù)是(shì)人(rén)工(∏¥÷gōng)交聯的(de)帶有(yǒu)能(néng)解離(lí)基團的(de)有(yǒu)機(jī)高(gāo)分(fēn)子(zǐ)，如(rú)離(lí)子(zǐ)交換樹(shù)脂、離(lí)子(zǐ)交換纖維素、離(lí)子(zǐ)交換凝& ®‌膠等。帶陽離(lí)子(zǐ)基團的(de)，如(rú)磺酸基（—SO3H）、羧甲基（&mdash✘≈;CH2COOH）和(hé)磷酸基等為(wèi)陽♥"≥✘離(lí)子(zǐ)交換劑。帶陰離(lí)子(zǐ¥δ)基團的(de)，如(rú)DEAE—（二乙基胺乙基）和(hé)QAE—（四級胺乙& 基）等為(wèi)陰離(lí)子(zǐ)交換劑。離(lí)子(zǐ)交換層析隻适用(yòng)于能(néng)在水(shuǐ)中解♥←離(lí)的(de)化(huà)合物(wù)，包括有(yǒu)機(jī)物(wù)和(hé)無機(jī)物(wù)。對(duì)于蛋白(bái)質、核酸、氨基酸及核苷酸的(de)分(fēn)離(lí)分(fēn)析有(yǒu)極Ω×好(hǎo)的(de)分(fēn)辨力。離(ε♣lí)子(zǐ)交換基團在水(shuǐ)溶液中解離(lí)後，能(néng)吸引水(shuǐ)中被分(fē÷♦'n)離(lí)物(wù)的(de)離(lí)子(zǐ)，各♦β©種物(wù)質在離(lí)子(zǐ)交換劑上(shàng)的(de)離(lí)子(zǐ)濃度與周圍溶液的(de)離(lí)↓ 子(zǐ)濃度保持平衡狀态，各種離(lí)子(zǐ)有(yǒu)不(bù)同的(de)交換常數(shù)，∞≈K值愈高(gāo)，被吸附愈牢。洗脫時(shí)，增γ↔φ 加溶液的(de)離(lí)子(zǐ)強度，如(rú)改變pH，增加鹽濃度，離(lí)子(zǐ)★₩被取代而解吸下(xià)來(lái)。洗脫過程中，按K值不(bù)同，分(fēnλ♥≥)成不(bù)同的(de)區(qū)帶。

◆凝膠過濾層析

支持物(wù)是(shì)人(rén)工(gōng)合成的(de)交聯高(gāo₽∑₽γ)聚物(wù)，在水(shuǐ)中膨脹後成為(wèi)凝膠。凝膠內(nèi)為(wèi)♠↔‍‍內(nèi)水(shuǐ)層，凝膠周圍的₩∑₽(de)水(shuǐ)為(wèi)外(wài)水(shuǐ)層。控♣‌φ制(zhì)交聯度以形成不(bù)同孔徑的(de)網狀結構。交聯度小(xiǎo)的(de)孔徑大(dà)，交聯度大(dà)的(de)孔徑小(xiǎo)。凝膠隻允許被分($≈¶ fēn)離(lí)物(wù)質中小(xiǎo) ≠∏于孔徑的(de)分(fēn)子(zǐ)進入，大(dà)于孔徑的(de β™)分(fēn)子(zǐ)被排斥在外(wài)水(shuǐ)層，最先被洗<₹脫下(xià)來(lái)。而進入孔徑的(×§$σde)分(fēn)子(zǐ)也(yě)按分(fēn)子(zǐ)®∏↓±量大(dà)小(xiǎo)大(dà)緻分('©fēn)離(lí)成不(bù)同的(de)區(q♠εσū)帶。選擇不(bù)同規格的(de)凝膠，可(kě)把≠✔←一(yī)個(gè)混合物(wù)按分(fēn)子(zǐ)量的(de)差異分(fēn)成不(bù)同的(¶≥∞de)組分(fēn)。這(zhè)種方法曾被稱為(wèi)分(fēδαn)子(zǐ)篩。目前常用(yòng)的(de∏σε÷)凝膠商品有(yǒu)：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和(hé)聚苯乙烯凝膠（styragel）等。

◆親和(hé)層析

在一(yī)對(duì)有(yǒu)專一(yī)的(de)相(xiàng®♥‍β)互作(zuò)用(yòng)的(de)物( ↔wù)質中，把其中之一(yī)聯結在支持物(wù)上(shàng✔→)，用(yòng)于純化(huà)相(xiàng)對(duì)的(de)另一(yī)物₹"(wù)質。常見(jiàn)的(de)親和(hé)對(duì)如(rú)：酶和(hé)抑制(zhì)劑，抗原和(hé)抗體(tǐ)，激素和(hé)受體(tǐ)等。支持物(wù)為(wèi)瓊脂糖或纖維素等。

◆氣相(xiàng)層析

屬于分(fēn)配層析或吸附層析，僅适用(yòng)于分(fēn)析分(fēn)離(lí)≈↓γσ揮發性和(hé)低(dī)揮發性物(wù)質。固定相(xiàng)是(shì)在惰性支持物(wù)（如(rú)磨細的(de)耐火(huǒ)磚）上(shàng)覆蓋一(yī)層高(gāo)₩φ沸點液體(tǐ)，如(rú)矽油、高(gāo)沸點石蠟和(hé)油脂、環氧類聚合物(wù)。外(wài)塗層約為(wèi)支持物(‍≈♥♠wù)重量的(de)20%。分(fēn)析時(shí)操作(zuò✔∑>)溫度範圍，一(yī)般從(cóng)室溫到(dào)200℃。特殊的(de)層析柱能(néng)達到(dào)500℃。流動相(xiàng)常用(yòng)氦、氩或氮為(wèi)展層氣體(tǐ)。↓ ≈氣相(xiàng)層析分(fēn)離(lí)的(de)區(qū)帶十分(fēn)清晰，是(≈♦shì)由于揮發性物(wù)質在兩相(xiàngπα§)間(jiān)能(néng)很(hěn)快(kuài∞₹∞)達到(dào)平衡，所需分(fēn)析時≤β‍(shí)間(jiān)大(dà)為(wèi)縮短(duǎn)，一☆↑(yī)般為(wèi)數(shù)分(fēn)鐘(zh←©∞ōng)至10餘分(fēn)鐘(zhōng)。檢測記錄系統繪出的•∏(de)各峰是(shì)測定流出氣體(tǐ)電(diàn)阻變化(huà)的(d♠♦e)結果，因而測定樣品量可(kě)到(dπσ∏•ào)微(wēi)克和(hé)毫微(wēi)克水(shuǐ)平。↑↑> 具有(yǒu)快(kuài)速、靈敏和(hé)微(wēi)量的(de)優點。氣相(xiàng)層析也(yě)能(néng)₹ε$♠用(yòng)于分(fēn)離(lí)制(zhì)備樣品，但(dàn)需增加将£≥流出氣體(tǐ)通(tōng)過冷(lěng)凍将分(fēn)離(lí)>物(wù)回收的(de)裝置。

◆紙(zhǐ)層析

以濾紙(zhǐ)為(wèi)支持物(wù)的(de)分(fēn)配層析。組成濾紙(zhǐ)的(de)纖維素是(shì)親水(shuǐ)物(wù)質σ→♥，能(néng)形成水(shuǐ)相(xiàng)和(hé)展層溶劑的(de)兩相(xiàng)系統，被分(fēn)離(lí) ☆物(wù)質在兩相(xiàng)中的(de)分(fēn)配保持平衡關系。紙(zhǐ)層¥ε析用(yòng)于分(fēn)析簡單的(de)混合物(wù)時(shí)可(kě)做(zuò)單向層析。對(duì★₹)于複雜(zá)的(de)混合物(wù)，可(kě)做(zuò)雙向層析。1944年(nián)A．J．P．馬丁第一(yī)次用(yòng)紙(zhǐ)層析分(fēn)析氨基酸，得(de)☆ <到(dào)很(hěn)好(hǎo)的(de)分(fēn)離(lí)效果，開(kāi)創了(l‌×σ→e)近(jìn)代層析的(de)發展和(hé)應用(yòng)↕ ¶β的(de)新局面。70年(nián)代以後，紙(zhǐ)層析已逐漸為(wèi)其他(tā)♣≠←↕分(fēn)辨力更高(gāo)、速度更快(kuài)和(hé)更微(wēi)↓ ∞©量化(huà)的(de)新方法，如(rú)離(lí)子(zǐ)交換層析、薄層層析、高(gāo)效液相(xiàng)層析等所代替。

◆薄層層析

在玻璃片、金(jīn)屬箔或塑料片上(shàng) ‌鋪上(shàng)一(yī)層約1～2毫∑≤¶米的(de)支持物(wù)，如(rú)纖維素、矽膠、離(lí)子(zǐ)交換劑、氧化(huà)鋁或聚酰胺等，根據需要(yào)做(zuò)不(bù)同類型的(de)層析。聚酰胺薄膜是(shì)一(yī)種特異的(de)薄層，将尼龍溶解于濃甲酸中，塗在滌綸片基上(shàng)，當甲酸揮發後，在滌綸片基上(shàn₹β¥g)形成一(yī)層多(duō)孔的(de)薄膜，γ∞其分(fēn)辨力超過了(le)用(yòng)尼龍₽↔粉鋪成的(de)薄層。薄層層析較紙(zhǐ)層析優越在于分(fēn)辨高(gāo)，展層時(shí↑∏☆)間(jiān)短(duǎn)。例如(rú)用(yòng)紙(zhǐ)層析做(zuò)氨基酸分(fēn)析，往往需要(yào)兩天時(shí)間(jiān)↔¥→，而且對(duì)層析條件(jiàn)要(yào)求嚴格，不(bù÷•£)易得(de)到(dào)滿意的(de)分(fēn)離(lí) δ✔效果。如(rú)用(yòng)薄層層析做(zuò)，一(yī)般約需半小(xiǎo)∑↕‌ 時(shí)，分(fēn)離(lí)效果更好(hǎo)。薄層層析一(yī)般用(yòn<®¶g)于定性分(fēn)析。也(yě)能(néng)用(yòng)&®✘于定量分(fēn)析和(hé)制(zhì)備樣品。

◆高(gāo)效液相(xiàng)層析（又(yòu)名高(gāo)壓液相(xiàng)色譜）

70年(nián)代新發展的(de)層析法。φφ∞ 其特點是(shì)：用(yòng)高(gāo)壓輸液泵，壓強最高(gāo)可(kě)達5000ps®★π&i（相(xiàng)當于34個(gè)标準大(dà)氣壓）。用(yòng)直徑約3～10微(wēi)米的(de)超細支持物(wù)裝填均勻的(Ω↑ de)不(bù)鏽鋼柱。常用(yòng)的(de)支持物(wù)是∏÷(shì)在玻璃小(xiǎo)珠上(shàng)塗一(yī)層1～2微(wēi)米的(de)二氧化(huà)矽，經硫酰氯反應生(shēng)成Si—Cl，進一(y<'ī)步連接疏水(shuǐ)的(de)烷基，如(rú)Si—C18H37，或λ×₩陽離(lí)子(zǐ)交換基團—Si（C ×♦H2）n—C6H4SO3H，或陰離(lí)子(zǐ)交換基團—Si（CH2）nNH2。這®↓∏(zhè)種支持物(wù)能(néng)承受很(hě♦<n)高(gāo)的(de)壓力，化(huà)學性能(néng)穩定。用(yòng)不(✘₹bù)同類型支持物(wù)的(de)HPLC，可(kě)做(zuò)吸附層析、離(lí)子(zǐ)交換層析和(hé)凝膠過濾層析。其分(fēn)析微(wēi)量化(huà)<≥× 可(kě)達10-10克水(shuǐ)平。但(dàn)用(yò×±ng)于制(zhì)備，可(kě)以純化(huà)上(shàng)克的(de)樣品。展層時(shí)間(jiān)短(duǎn)，一(yī)般需幾分(f£÷§σēn)鐘(zhōng)到(dào)10餘分(fēn)鐘(zhōng)。其分(f✘>ēn)析速度、精确度可(kě)與氣相(xiàng)層析媲美(měi)。HPLC适于分(fēn)析分(fēn)離 <∏÷(lí)不(bù)揮發和(hé)極性物(wù)質。而氣相(xiàng)層析隻适用∑±∏(yòng)于揮發性物(wù)質，兩者互為(wèi)補充，都(dōu)是(shì)目前最為(wèi)理(lǐ≥←)想的(de)層析法。HPLC配有(yǒ₹$u)程序控制(zhì)洗脫溶劑的(de)梯度混合儀，數(shù)據處理(lǐ)的(de)積分(fēn)儀和(hé)記錄λΩ★儀等電(diàn)子(zǐ)系統，成為(wèi)一(yī)種先進的(de∞"£←)分(fēn)析儀器(qì)，在生(shēng)物(wù)化(huà)學、化(huà)學、醫(yī)藥學和(hé)環境科(kē)學的(de)研究中發揮了(le)重要(yào)作(zuò)用(yòng)。

◆反相(xiàng)層析

在吸附層析中，高(gāo)極性物(wù)質在層析柱上(shàng)吸附較牢，洗脫時(shí)發生(shē≈×♦↔ng)拖尾現(xiàn)象和(hé)保留時(shí)間(jiān)長(&₩↔£cháng)的(de)問(wèn)題。如(rú)果在支λ≥持物(wù)上(shàng)塗上(shàng)一(yī)層高(gā✘↓‍o)碳原子(zǐ)的(de)疏水(shuǐ)性強的(de)烷烴類，洗脫液用(yòng)極性強的(de)溶劑，如(rú)甲醇和(hé)水(shuǐ)的(de)混合物(wù)。則被分(fēn)離(lí)樣品中的(de)極性強的(de)物(wù)質不(bù)被吸附，最先 ✘洗下(xià)來(lái)，得(de)到(dào)較好(hǎo)的('≥¥de)分(fēn)離(lí)效果。這(z>•hè)種層析法與普通(tōng)的(de)吸附層析法相(xiàng)反，故稱為(wèi)反相(xiàng)層析≤¶。目前用(yòng)HPLC做(zuò)↓←↔♥反相(xiàng)層析常用(yòng)的₩♣₩γ(de)ODS柱，即在支持物(wù)的(de)表面上(shàng)連接了(le)C18H37☆® ±Si—基團。

◆同系層析

在核酸分(fēn)析中，将樣品經核酸酶部分(fēn)裂解成不(bù)同長(cháng)度的(de)核苷酸片段，用(yòng)同位素标記後，在DEAE纖維素薄層上(shàng)分(fēn✔γ)離(lí)，用(yòng)含有(yǒu)未标記的(de)相(xiàng)同™∞的(de)核苷酸片段作(zuò)展層溶劑，這(zhè)樣，未标記的(de)核苷酸把标記過的(de)核苷酸推↕∑♣‌進，使按分(fēn)子(zǐ)量大(dà)小( xiǎo)不(bù)同把标記核苷酸片段，按由小(xiǎo)到(dào)大(dà)的(de)次序排αδ≥‌列，達到(dào)分(fēn)離(lí)的(de)目的(de)。于是(shì)把這(zhè π₹)種層析法稱為(wèi)同系層析。同系層析和(hé)電(diàn)泳相(xiàng)結合曾用(§γ≤&yòng)于寡核苷酸的(de)順序分(fēn)析。

紙(zhǐ)層析是(shì)層析法的(de)一(yī)種,要Ωα✔∑(yào)了(le)解紙(zhǐ)層法還(hái)得(de)>₽¶©從(cóng)層析法開(kāi)始.層析法又(yòu)稱色層分(fēn)析法或色譜法（Chromatography），是(shì)一(yī)種基于被分(fēn)離(lí)物(‌€•♥wù)質的(de)物(wù)理(lǐ)、化(‍βhuà)學及生(shēng)物(wù)學特性的(de)不(∞≤®≥bù)同，使它們在某種基質中移動速度不(bù)同而進行(xíng)分(fēn)離(lí)和‍φδ(hé)分(fēn)析的(de)方法。例如(rú)：我們利用(yò <§ng)物(wù)質在溶解度、吸附能(néng)力、立體(tǐ)化(huà)學特性£™>及分(fēn)子(zǐ)的(de)大(dà)小(xiǎo)、帶電(diàn)情況及離(lí)子(zǐ)交換、親和(hé)力的(de)大(dà)小(xiǎo)及特異的(de)生(shē< ©ng)物(wù)學反應等方面的(de)差異，使其在流動相(xiàng)與固定相(xiàng)之間(jiān)的(de)分(fēn)配α≈∑β系數(shù)（或稱分(fēn)配常數(shù)）不(bù)同，達到(dào)彼此分(fēn)離(lí)的(de)目的(de)。

層析法的(de)最大(dà)特點是(shì)分(fēn)離(lí)效率高(gāo)，它能(néng)分(fēn)>∑離(lí)各種性質極相(xiàng)類似的(de)物(wù)Ω¥質。而且它既可(kě)以用(yòng)于少(shǎ↓±αo)量物(wù)質的(de)分(fēn)析鑒定，又(yòu)可(k↑ě)用(yòng)于大(dà)量物(wù)質的(de)分(fēn)離(lí)純化(huà)制(zhì)備。因此，作(zuò)為(wèi)一(yī★®←<)種重要(yào)的(de)分(fēn)析分(fēn)離(lí)手段與方法，它廣泛地↓$®§(dì)應用(yòng)于科(kē)學研究與工(gōng)業(yè)生(shēnλ'$g)産上(shàng)。現(xiàn)在，它在石油、化(huà)工(gōng)、醫(yī)藥衛生(shēng)、生(shēε ₩£ng)物(wù)科(kē)學、環境科(kē)學、農(nóng)業(yè)科(kē)學等領域都(dōu)發揮著(zhe)十分(fēn)重↑∞要(yào)的(de)作(zuò)用(yòng)。

層析根據固定相(xiàng)基質的(de)形式分(fēn)類，層析可(kě)以分₽☆(fēn)為(wèi)紙(zhǐ)層析、薄層層析和(hé)柱層析。其中紙(zhǐ)層析是(shì)指以濾紙(zhǐ)作(zuò)為(wèi)基質的(de)層析。

5層析發展編輯

起步期

在層析技(jì)術(shù)發展之初，對(duì)于一(yī)些(xiē)物(wù)質的(d£λπλe)分(fēn)離(lí)方式都(dōu)處在比較原始的(de)狀态，并≠↔且分(fēn)離(lí)的(de)結果也(yě)并不(bù)是(shì ∏♣β)很(hěn)理(lǐ)想。
　　bio-rad專家(jiā)談到(dào)層析技(jì)術(shù)最初是(shì" •←)在1903~1906年(nián)由俄國(guó)植物(wù)學家(jiā)M≠≈φ.Tswett首先提出來(lái)的(de)。
　　那(nà)時(shí)，他(tā)将葉綠πΩ(lǜ)素的(de)石油醚溶液倒入碳酸鈣管柱，并繼續以石油醚淋洗，由于碳酸鈣✘εφ對(duì)葉綠(lǜ)素中各種色素的(de)吸附能(néng)力不(bù)同，所以≤¶β色素被逐漸分(fēn)離(lí)，在管柱中出現(xiàn)了(le)不¶δδ‌(bù)同的(de)色譜圖。于是(shì)就(jiù)稱®λ×≈這(zhè)種混合物(wù)的(de)分(fēn)離(lí)方法為(wèi)，有(↕₩yǒu)色的(de)圖譜法（Chromato+graphyγ→），簡稱色譜法，又(yòu)叫層析法。不(bù)過，當時(shíα✘∏)這(zhè)種方法并未引起人(rén)們♣•的(de)注意。

接下(xià)來(lái)随著(zhe)科(kē)學技(j'÷'ì)術(shù)的(de)發展以及生(shēng)産實踐的(de)需要(yào)，層βδ析技(jì)術(shù)也(yě)得(de)到(dào)了(le)迅速的₹ &(de)發展。這(zhè)裡(lǐ)就(jiù)不(bù)得(dφ←e)不(bù)提到(dào)兩位在層析技(j₽ λì)術(shù)發展史上(shàng)做(zuò)出重要(yào)貢獻的• (de)人(rén)，他(tā)們是(shì)英國(guα ó)生(shēng)物(wù)學家(jiā)馬丁（Mart'≠★in）和(hé)辛格（Synge）。是(shì)他(tā)們首先 ☆提出了(le)色譜塔闆理(lǐ)論。

色譜塔闆理(lǐ)論其實是(shì)基于熱(rè)力學近(jìn)似的(de• <)理(lǐ)論，這(zhè)個(gè)理(lǐ)≠÷ ÷論中涉及的(de)對(duì)象有(yǒu)目标分(fēn)離(lí)物(wù)，色譜柱。這←'δ≥(zhè)裡(lǐ)色譜柱好(hǎo)比是(sh∞♠∞"ì)一(yī)個(gè)分(fēn)餾塔。理(lǐ)論是(✘™shì)這(zhè)樣的(de)：将目标分(fēn)離(lí)物(wùα→₹)倒入“分(fēn)餾塔&rdquoπα;，這(zhè)樣就(jiù)會(huì)在分(fēn)餾塔闆間(jiān)‍<移動，在每一(yī)個(gè)塔闆內(nèi)組分(fēn)分(fēn)β≈ε×子(zǐ)在固定相(xiàng)和(hé)流動相(xiàng)之間(jiān)形成平衡₽¶✘，随著(zhe)流動相(xiàng)的(de₹ )流動，組分(fēn)分(fēn)子(zǐ✔•§)不(bù)斷從(cóng)一(yī)個♦δ(gè)塔闆移動到(dào)下(xià)一(yī)個(gè)塔闆，并不(bγ÷ù)斷形成新的(de)平衡。一(yī)個(gè)色譜柱的(de)塔闆數(shù)越多(§ ✘duō)，則其分(fēn)離(lí)效果也(yě)就(jiù)越好(hǎo)。這(zhè)個¶σ(gè)分(fēn)離(lí)過程提升分(fēn)離(lí)效率，并且定←®↓量的(de)進行(xíng)描述，分(fēn)σ≥"析這(zhè)個(gè)分(fēn)離(lí)過程。
　　這(zhè)是(shì)個(gè)進步 γ¶§，并且馬丁（Martin）和(hé)欣革λ♣☆（Synge）還(hái)提出更為(wèi)遠(yuǎn)見(jiàn)卓識的($↔>&de)預言：1、流動相(xiàng)可(kě)用(yòng)氣體(tǐ)代替液體±₹(tǐ)，因為(wèi)與液體(tǐ)相(☆€xiàng)比，分(fēn)離(lí)時(shí)候，物(wù)質間(ji¥<ān)作(zuò)用(yòng)力更小(xiǎo)，對(duì)分(fēn)離><♥±(lí)也(yě)就(jiù)更有(yǒu₽>)好(hǎo)處。2、若能(néng)夠使用(yòng)非常細的(de)顆粒填料，并↑₹Ω→在色譜柱兩端施加較大(dà)的(de)壓差，從(cóng)而增加了(le)理(lǐ)論培闆λ♥'€數(shù)，這(zhè)将會(huì)大(d↑₹♥à)大(dà)提高(gāo)分(fēn)離(lí)效率。

發展期

上(shàng)世紀60、70年(nián)代是(shì)色譜©↔¥/層析技(jì)術(shù)快(kuài)速發展✔↔的(de)時(shí)代，首先是(shì)層析介質有(yǒu)了(le)飛(fēi)↑✘←↓速的(de)發展，各種人(rén)工(gōng)合成的(de)介質δ↕₹出現(xiàn)，如(rú)矽膠、聚苯乙烯二乙烯基樹(shα £ù)脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等樹(shù)脂或凝膠的(de)出現(xiàn)，極大(dà)π↕地(dì)拓展了(le)層析技(jì)術(shù)的(de)應×≥✔用(yòng)領域和(hé)範圍，基于不↓•‍(bù)同介質的(de)層析方法也(yě)如(rú)雨γ ™★(yǔ)後春筍般不(bù)斷湧現(xiàn)。

現(xiàn)代層析法特點

色譜法或是(shì)層析法是(shì)簡單點說(shuō)，就(jiù)是(shì★"↑)依據被分(fēn)離(lí)物(wù)的(de)物(w♥★ù)理(lǐ)、化(huà)學及生(shēng)物(wù)學特性的(de)不(bù)同，使它$₩σ 們在某種基質中移動速度不(bù)同而進行(xíng¶±)分(fēn)離(lí)和(hé)分(fēn∏ )析的(de)方法。^[1]