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牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測試劑盒的(de)性能(néng)評價

[ 更新時(shí)間(jiān)：2013-08-16 ]

牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測試劑盒的(de)性能(néng)評價×•∏$

羅海(hǎi)峰葛豔華 Gu Hao—yi Anton Mestek Jr．翁立 ®Ω楠

Christian Schelp。Christoph Egli。Serge Leterme

1．北(běi)京愛(ài)德士元亨生(shēng)物(wù)科(kē)技(jì)有✔λ(yǒu)限公司，北(běi)京1013♥✔00；2．IDEXX Laboratories Inc．，Wes₹δσ☆tbrook-Maine 04092；3．IDEXX Switzerland A∞©G ，Liebefeld—Bern 3097

摘要(yào) 為(wèi)了(le)評價牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(BVDV Ag POα←♦≤C)試劑盒的(de)性能(néng)，選擇E 蛋白(bái)、不(bù)同亞型的"♣(de)BVDV抗原陽性血清以及大(dà)量采集于牛場φ☆(chǎng)的(de)全血、血漿和(h₩<←✔é)小(xiǎo)耳組織樣本，用(yòn ∞g)IDEXX的(de)BVDV Ag EL≥"$ISA和(hé)BVDV Ag POC同時(shí)進行(xíng)檢 >££測。結果表明(míng)：BVDV Ag POC可(kě)以有(yǒu)效檢測E一(yī)蛋白₽>(bái)，且對(duì)于E 蛋白(bái)的(de)稀釋靈敏度π與EHSA方法一(yī)緻；對(duì)于BVDV 1型和(héγ©ε)2型病毒都(dōu)可(kě)以有(yǒ↕★♣u)效檢出；對(duì)824份全血樣本、587份血漿樣本以及400份小(xiǎo)耳組織樣本的÷δ§(de)檢測結果顯示，所有(yǒu)持續感染牛均被檢出，靈敏度達到(♥↑Ωdào)100％，特異性也(yě)超過99％；BVDVPOC與ELISA&"方法的(de)符合性很(hěn)好(hǎo)；該牛病毒性腹瀉病毒抗原®π♦即時(shí)檢測試劑盒可(kě)以實現(xiàn)不(bù)同類型牛場(chǎng)對(duì)αδ于持續感染牛的(de)快(kuài)速檢測，作(zuò)為(wèi)一>£×ε(yī)個(gè)有(yǒu)用(yònσ☆‍g)的(de)工(gōng)具可(kě)以幫★§助牛場(chǎng)進行(xíng)BVD的(de)防控及清除。

關鍵詞 牛病毒性腹瀉病毒；即時(shí)檢測；靈敏度；特異性；性能(néng₩‍)；評價

牛病毒性腹瀉一(yī)黏膜病(bovine viral diar—r ☆Ωhea—mueosal disease，BVD—MD)是(π∏♠shì)由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引§♥起的(de)主要(yào)發生(shēng)于牛的( β de)一(yī)種急性、熱(rè)性傳染病，在臨床上(shàng)引起一(yī)系×↑♥✔列複雜(zá)的(de)症狀，主要(yào)↔§¥包括牛的(de)病毒性腹瀉、急慢(màn)性黏膜病、免≥↕φ疫耐受和(hé)持續性感染、免疫抑制(zhì)、繁殖障礙、血小(xiǎoλ®)闆減少(shǎo)和(hé)出血症等，緻病機(jī)理(lǐ)非常複雜(zá)，嚴重影(yǐngσ×♥)響養牛業(yè)生(shēng)産的(de)各個ε→‍☆(gè)環節。同時(shí)，牛病毒性腹瀉病毒是("λαshì)一(yī)種世界範圍廣泛分(fēn)布的(♠♦↑de)危害動物(wù)健康的(de)重要(yào)病原體(tǐ)，它不(® bù)僅感染牛，而且能(néng)夠感染豬、綿羊、山(shān)羊、鹿、駱駝及其∏×§它野生(shēng)動物(wù)。

妊娠母牛感染非緻細胞病理(lǐ)變化(huà)型BVDV後，此時(sh← í)胎兒(ér)的(de)免疫系統尚未發育成熟，↔π不(bù)能(néng)識别外(wài)來δ₩(lái)的(de)BVDV，初生(shēng)犢牛β×一(yī)旦成活，其臨診症狀表現(xiàn)正常，血清學反應呈陰性，而此時(shí)↔♣¶λ犢牛則處于免疫耐受狀态，成為(wèi)持續感染(Persistent€β ly infected，PI)者，持久帶毒、排毒，PI牛 $≠→也(yě)就(jiù)成為(wèi)了(le)BVDV在牛群中流♠φ∞∞行(xíng)的(de)傳染源。有(yǒu)些§♣$π(xiē)P1牛會(huì)表現(xiàn)出黏膜病的(de)症狀(腹瀉、發育不(b"♥&φù)良、久配不(bù)孕等)，但(dàn)是(shì)有(yǒu)些α£↑(xiē)PI牛不(bù)表現(xiàn)任何★±π₹症狀，從(cóng)而被當作(zuò)正常牛♦εσ隻一(yī)直在牛群飼養圈，并使BVDV在牛群中傳播。可(kě)← ₽≤見(jiàn)對(duì)于BVDV持續φ•感染牛的(de)檢測将有(yǒu)利于牛群生(shēng)長(cháng)發φ§$育。本文(wén)對(duì)于新近(jìn)開(kāi)發的(de)牛病毒性腹瀉φ&★病毒抗原即時(shí)檢~(BVDV Agσ> POC)試劑盒的(de)性能(néng)進行(xíng)了(le)評價，通(¥≥tōng)過與酶聯免疫吸附試驗(ELISA€≥)進行(xíng)比較探索其用(yòng)于檢測BVDV持續感染牛

的(de)可(kě)行(xíng)性。

1 材料與方法

1.1 材料

E^m8 (gp48)蛋白(bái)由IDEXX Switzerland AG瑞士♠•€←研發中心提供；不(bù)同亞型BVDV抗原陽性血清樣本由IDEXX Labor£₹atories Inc．美(měi)國(guó)✔λ研發中心提供；BVDV Ag ELISA試劑盒及BVDV ∞∑‌¶Ag POC試劑盒均來(lái)自(zì)于IDEXX Labora↕φ'←tories Inc．；全血樣本、血漿樣本以及小(xiǎo)耳組織樣本來(lái)自(™$εzì)于牛場(chǎng)。

1.2 方法

1)BVDV Ag ELISA檢測血清血漿的(de)操作(zuò)方法。血清血漿樣本直接✔$≥↕加入到(dào)ELISA闆內(nèi)，按照(zhào)産品說(sδ ‍®huō)明(míng)書(shū)進行(xíng)孵育和 φ'(hé)後續操作(zuò)。設2孔陰性對(duì)照(zhào)和(hé)2孔陽性對( ₩®®duì)照(zhào)，陽性對(duì)照(π•♠>zhào)平均值減去(qù)陰性對(duì)照(zhào)平均值，其差必須大 ↑©(dà)于或等于0．150；通(tōng)過計(jì)算(suàn)每個(gè)樣品與陰性對(du↕ ì)照(zhào)平均值的(de)差值(S-N)來(lái)判定BVDV抗原結果。如& ☆(rú)果(S-N)值小(xiǎo)于或等于0．300，判為(wèi)BVDV≈≤™✘抗原陰性；如(rú)果S-N值大(dà)于0．300，判為(wèi)& >‍BVDV抗原陽性。

2)BVDV Ag ELISA檢測小(xiǎo)耳組織樣本的(de)操作(zuò)方法。對(duì)于小(xiǎo)β≤≤耳組織樣本首先采用(yòng)耳組織浸泡液在室溫下(xià)浸泡12～24h後σ"，混勻，取樣加入ELISA闆內(nèi)，按照(zhào)産品說(s£•huō)明(míng)書(shū)進行(xíng&¥•¶)孵育和(hé)後續操作(zuò)。設2孔陰性對(‍ ‌duì)照(zhào)和(hé)2孔陽性對∏★(duì)照(zhào)，陽性對(duì)照(zhào)平均←σπ‍值減去(qù)陰性對(duì)照(zhào)平均值，其差必須大(dà)于或等于0．150；通<♣≠(tōng)過計(jì)算(suàn)每個(gè)樣品與陰性對(duì)照σγ<€(zhào)平均值的(de)差值(S-N))來(lái)判定BVDV抗原結果。如(rú$✔&✔)果S-N值小(xiǎo)于或等于0．200，判為(wèi)BVDV抗原陰性；如(rú)果&€S-N值小(xiǎo)于或等于0．300

但(dàn)大(dà)于0．200，判為(wèi)可(kě)疑÷÷'；如(rú)果S-N值大(dà)于0．300，判為("✔£wèi)BVDV抗原陽性。

3)BVDV持續感染牛的(de)判定。對(duì)于第1次采樣檢測B♥₩VDV抗原陽性的(de)牛隻，在7～14d後再次進行(xíng)采樣，并使用(y₩↑∞òng)BVDV Ag ELISA進行(xíng)‍¥‍>檢測。如(rú)果再次檢測為(wèi)BVDV抗原陽性，則該γα動物(wù)為(wèi)BVDV持續感染牛；如(rú)果再次檢測結果為(wèi)BVD₩‌←≠V抗原陰性，則該動物(wù)不(bù)是∞€↔(shì)BVDV持續感染牛。

4)BVDV Ag POC檢測全血、血清和(hé)血漿的(de)操作(zuò)>β<≠方法。将檢測裝置放(fàng)在平整的(de)桌面→↕♣上(shàng)，使用(yòng)提供的(de)滴•®π管滴将1滴樣本滴人(rén)檢測裝置的(de)加樣♣™孔中，lmin內(nèi)滴加2滴緩沖液并且開(kāi)始計(jì)時(shí♠✔Ω₹)，15min後觀察結果；質控線位置呈現(xiàn)紅(hóng)色條帶顯示試驗有(yǒu)效"φ‌；檢測線的(de)顔色強于背景結果，判為(wèi)陽性；檢測線的(de)顔色與背景顔色相(x♦"iàng)同或弱于背景顔色，結果為(wèi)陰性。

5)BVDV Ag POC檢測耳組織樣本的(de)操作(zuò)方法。耳組織樣本裝入↑∑樣品管中，然後滴加8滴(對(duì)于小(xiǎ±o)耳組織樣本)或者16滴(對(duì)于大(‌☆dà)耳組織樣本)緩沖液，浸泡5min以上(shàng)，徹底混勻後使用(yòng β<)提供的(de)滴管滴将1滴樣本滴人(rén)檢測裝置的(✔¶Ωde)加樣孔中，1min內(nèi)滴加2滴緩沖液并且開(kāi)始計(jì)≤≠ε時(shí)，15min後觀察結果。質控線位置呈現(xiàn)¶≠紅(hóng)色條帶顯示試驗有(yǒu)效；檢∑✔σ測線的(de)顔色強于背景顔色，判為(wèi)陽性；檢測線≤∑↕的(de)顔色與背景顔色相(xiàng)同或弱于背景，結果為(wè →γ¥i)陰性。

2 結果與分(fēn)析

2.1 對(duì)于E 蛋白(bái)的(de)檢測及稀釋靈敏度比較

對(duì)于采用(yòng)基因工(gōng)程表達的(de)E一(yī)'×↔蛋白(bái)進行(xíng)系列稀釋，并且↕₽采用(yòng)BVDV Ag ELISA和(hé)BVDV Ag POC分(fēn)别進行♣↔•(xíng)檢測，檢測結果見(jiàn)表1。

由表1可(kě)見(jiàn)，BVDV Ag ₹₽÷POC可(kě)以有(yǒu)效檢測E ，并且對(duì)于E^m8的(de)稀釋靈敏度與ELISA相(xiàng)同®₽♠ε。

2.2 對(duì)于BVDV 1型和(hé)2型血清的(de)¶λ≤☆檢測

使用(yòng)BVDV Ag POC檢測2l份已知(zhī)病 ≤毒亞型的(de)BVDV Ag陽性血清，其中包含有(yǒu)13份BVDV 1

由表2可(kě)見(jiàn)，BVDV Ag POββ≥✘C可(kě)以有(yǒu)效檢測BVDV 1型和(hé)2型病毒。

2.3 對(duì)于全血樣本的(de)檢測

自(zì)9個(gè)牛場(chǎng)收集824份全血樣本™‍，采用(yòng)BVDV Ag POC進行(xíng)檢測，記錄結果。←₩采用(yòng)BVDV Ag

ELISA對(duì)于全血樣本分(fēn)離(lí)得(de)到(dào)的(de)血↔" 漿進行(xíng)檢測，對(duì)于陽性結果的(♥γ₹→de)牛隻1周以後再次采血進行(xíng)檢測，如(rú)果≤£☆‌再次為(wèi)陽性，則判定為(wèi)持續感染(PI)，并且記錄相(x→★iàng)應結果。将BVDV Ag POC檢測結果與BVDV AgELISA檢測的(de™©✔)PI結果相(xiàng)比對(duì)，BV‍<DVAg POC對(duì)于全血樣本檢測的(de)♥αε♦靈敏度是(shì)100.0％，特異性為(wèi)99.1％。

2.4 對(duì)于血漿樣本的(de)檢測

自(zì)9個(gè)牛場(chǎng)收集587份血漿樣本，采用(yò★♣©ng)BVDVAg POC進行(xíng)檢測，記錄結果；同時(shí)采用(yòn₽→g)BVDV AgEUSA進行(xíng)檢測，對(duì)于陽性結果的(de)牛隻1周以後再φ"•次采血進行(xíng)檢測，如(rú)果再次為(wΩ♥≥♣èi)陽性，則判定為(wèi)持續感染，并且記錄相(xiàngβ↕)應結果。将BVDV Ag POC檢測結果與BVDV Ag ELISA檢測的(de☆¥)PI結果相(xiàng)比對(duì)，BVD₹₹¥"VAg POC對(duì)于血漿樣本檢測的(de)靈敏度是(shì)100．0♦φ％，特異性為(wèi)99．4％。

2.5 對(duì)于耳組織樣本的(de)檢測

自(zì)4個(gè)牛場(chǎng)收集400份小(xiǎo)$↓ 耳組織樣本，采用(yòng)BVDV Ag POλγ★C進行(xíng)檢測，記錄結果；同時(♥®shí)進行(xíng)BVDVAg ELISA檢測，對(duì)于陽 ★σ性結果的(de)牛隻1周以後再次采樣檢測，如(rú)果再次為(wèi)陽性，則✔≤判定為(wèi)持續感染，并且記錄相(xiàng)應結♦≈¶果。将BVDV Ag POC檢測結果與BVDV Ag ELISA檢測的(de)PI結果相(xià→§ng)比對(duì)， BVDVAg POC對(duì)于全血樣本檢測的(de)靈敏度是(s∞₩>≥hì)100％，特異性為(wèi)100％∞₽φ。

3 討(tǎo)論

目前OIE推薦的(de)BVDV抗原檢測方法，也(yě)是(shì)國(guó)際貿易标準方法，¶ε包括病毒分(fēn)離(lí)(Virus Isolation)、酶聯免疫∑± 吸附試驗(ELISA)、免疫組化(huà)(Immunohisto-chemi₩α¶<stry)以及核酸檢測(Nucleic acid detection)~1。目✔₹Ω®前ELISA方法作(zuò)為(wèi)檢測牛病毒性≠•βΩ腹瀉病毒的(de)經典方法，已經被應用(yòng)于多(duō)Ω<個(gè)國(guó)家(jiā)的(de)淨化®>¥&(huà)計(jì)劃中，其特異性強、靈敏度和(h•∑±é)可(kě)靠性都(dōu)很(hěn)高(gāo)。但(dàn)是(shì)由←↓σ✘于目前OIE推薦的(de)4種方法均需要(yào)一(yī)↑♣♦≤定的(de)實驗條件(jiàn)，并且試驗結果需要(yà ↔∏✔o)經過幾小(xiǎo)時(shí)到(dào)幾天的(de)時(shí)¥¥間(jiān)才可(kě)獲得(de)。因此開(kāi)發一(yī)種靈敏度≤←®、特異性與ELISA方法相(xiàng)似，同時(shí)操作(zuò)簡便、不←× (bù)需要(yào)特殊儀器(qì)的(de)檢測方法≤"✔，對(duì)于小(xiǎo)型農(nóng)場(chǎng)的(de)♥'• 疾病防控，以及在需要(yào)盡快(kuài¥φ)獲得(de)檢測結果的(de)場(chǎng)合下(xi€←à)使用(yòng)，具有(yǒu)重大(dà)的(de)優勢。牛病毒『±©¥生(shēng)腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測試劑盒采用™ ε↔(yòng)膠體(tǐ)金(jīn)技(jì)術(shù≤λ)，運用(yòng)側向層析原理(lǐ)，可(kě) §π以在加入樣本後15min獲得(de)結果，→'•™所有(yǒu)反應在室溫下(xià)即可(kě)完成，不(bù)需要(y•δπào)任何其他(tā)儀器(qì)及特殊的(de)實驗條件(jiàn)，&✘完全達到(dào)快(kuài)速檢測的(de)要(yào)求，可(kě)以∑¶δ☆滿足各種環境下(xià)對(duì)于單一(yī)樣本快(kuà ₩✘ i)速檢測的(de)需求。

PI牛的(de)清除是(shì)牛場(chǎng)'&清除BVDV的(de)重要(yào)目标，運用(yòng)适當的(de∑♥¥)檢測手段檢出這(zhè)些(xiē)PI牛，一(yī)定要(yào)在第一(yī)時(shíδ×)間(jiān)将它們隔離(lí)出群，并盡早淘汰。實驗結果表，BVDV Ag POC檢測标的(♥§♦de)物(wù)為(wèi)E^m8，E^m8蛋白(bái)為(wèi)檢測BVDV的(₹✔de)重要(yào)靶蛋白(bái)，該試劑盒可(kě)以準确有(yǒu)效地₽↕(dì)檢測出樣本中BVDV的(de)存在；對(duì)♥§"≤于1型和(hé)2型BVDV均可(kě)以檢測。對(duì)于824份全血樣本、5ε÷$87份血漿樣本以及400份小(xiǎo)耳組織樣本的(de)檢測顯示，所有(y↓♠&ǒu)的(de)PI牛全被BVDV Ag POC檢測出，靈敏度達到( dào)100％，針對(duì)不(bù)同類型的(de)樣品，BVDV Ag POC特異性♠ 略有(yǒu)不(bù)同，但(dàn)都(dōu)超過99％。該結果顯示BVDV &↑Ag POC與ELISA方法具有(yǒu)極高(gāo)的(de)符合性，其性‍∑↔↑能(néng)可(kě)以滿足對(duì)于BVDV P$★♠ I牛檢測的(de)需求。

據文(wén)獻報(bào)道(dào)，對(duì$≈Ω)北(běi)京地(dì)區(qū)7個(gè)規模化(huà₹₩)奶牛場(chǎng)共14028頭荷斯坦奶牛進行•±(xíng)BVDV抗原檢測。共檢出PI牛58頭，其中成母牛9>♠‌$頭，後備牛49頭；場(chǎng)內(nèi)陽性率0.04～1.02％t61。從™∑>©(cóng)河(hé)北(běi)省部分(fēn)牛場(chǎng)采集1030殖與飼料2↔ 012份樣本進行(xíng)BVDV抗原檢測，平均‍♥↓檢出率40．9％㈣。可(kě)見(jiàn)，BVDV廣泛存在于國(guó)內(→α★nèi)的(de)牛場(chǎng)中。參照(zhào)瑞典淨化(huà)BVDV的(d β e)經驗，明(míng)确牛隻感染狀況，及時(shí)清除PI ≈牛，同時(shí)控制(zhì)引入的(de)牛隻，将有(yǒu)助于病毒的(de)←↑∞淨化(huà)。而BVDV Ag POC作(zuò)為(wèi)可(kě)以單一(♦yī)檢測的(de)快(kuài)速檢測試劑盒，可(kě)用(₹÷yòng)于及時(shí)明(míng)确新生(→πshēng)犢牛、引入牛隻的(de)BVDV感染狀況β¶₽ 。同時(shí)歐洲的(de)清除計(jì)劃也(yě)顯示出快σ↓✔(kuài)速确定牛隻感染狀況，也(yě)有(yǒu)利于清除病毒。由此，牛病毒性腹瀉病β→ε¶毒抗原即時(shí)檢測試劑盒作(zuò)為(wèi)一(yī)個(♣↑±♠gè)可(kě)以快(kuài)速檢測樣品中BVDV抗原的(de)試劑，可¥$★(kě)以成為(wèi)牛場(chǎng)進行(xíng)BVDV©<®的(de)防控及清除的(de)有(yǒu)力工(gōng)具。÷≤

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本文(wén)內(nèi)容摘自(zì)《養殖與δ≠α飼料2012第11期》