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食品中呋喃妥因代謝(xiè)物(wù)酶ε↔≥聯免疫檢測試劑盒的(de)研制(zhì)

[ 更新時(shí)間(jiān)：2013-08-19 ]

食品中呋喃妥因代謝(xiè)物(wù)酶聯免疫檢測試劑盒的(σ>de)研制(zhì)

摘要(yào)：目的(de) 開(kāi)發研制(zhì)快(kuài)速檢測呋喃妥因¥§代謝(xiè)物(wù)的(de)酶聯免疫檢測試劑盒。方法：依據直接競争E↕φ≈↕LISA原理(lǐ)，采用(yòng)包被法确定最佳抗體(tǐ)包被濃度和(hé)★₩酶标抗原工(gōng)作(zuò)濃度、包被條件(jiàn)、反應時×≠(shí)間(jiān)、底物(wù)顯色時(shí)間(jiān)等€•，并對(duì)試劑盒的(de)各項技(jì)術(shù)指标進行(xíng)确認 ←™。結果：成功的(de)組裝了(le)呋喃妥因的(de)酶聯免疫πΩ•×檢測試劑盒，并建立了(le)肌肉、肝髒、水(shΩ≤₩✘uǐ)産、蜂蜜等的(de)前處理(lǐ)方法，檢測限均遠(y♦πεuǎn)低(dī)于lug／kg。該試劑盒線性檢測範圍為(wèi)0～4．05ng♠≤／mL，IC₅₀浮動範圍0．30～0．60ng／mL，樣品的(de)闆內(n↓¥φ↑èi)、批內(nèi)、批間(jiān)的(de)變異系數(shù)均小(x€∑×iǎo)于15％，平均回收率在65％～90％之問(wèn)，與其同類藥物(wù)✔ ×®的(de)交叉反應率均小(xiǎo)于0.2%。結論：本研究研制δ>←(zhì)的(de)試刺盒重複性、再現(xiàn)'•性、特異性、穩定性各項指标均符合技(jì)術(shù)要(yào)求，可(kě)用(yòng≤≤•✔)于動物(wù)源性食品中呋喃妥因代謝(xiè)物(wù≤£)殘留的(de)檢測。

關鍵詞：食品；呋喃妥因；酶聯免疫

呋喃妥因(Nitrofurantoin)以及呋喃唑酮"∞λ(Furazolidone)、呋喃它酮Furaltadone)、呋喃西(x♠≤ī)林(lín)(Nitrofurazone)等硝基呋≥✘λ∞喃類抗生(shēng)素因其廣譜、高(gāo)效、廉價等特點被廣泛應用(yòng)于€↓家(jiā)畜、家(jiā)禽、水(shuǐ)産、蜂等動物(wù)傳染疾病的(de)ππ₹∑預防和(hé)治療。硝基呋喃類藥物(wù)在動物(wù)體(t¥✘↓‌ǐ)內(nèi)很(hěn)快(kuài)代謝(xièΩ♥>)，1一(yī)氨基一(yī)乙內(nèi)酰脲(AHD)是(≠"shì)呋喃妥因的(de)代謝(xiè)物(wù)，其內(nèi)服後随尿液大(dà)量排出，臨∞床上(shàng)主要(yào)用(yòng)于敏感菌所緻的(de)泌尿系統感≠↓λβ染，但(dàn)此類藥物(wù)及其代謝(xiè)物(wù)具有(≈≠'yǒu)很(hěn)強的(de)毒性，其在動物(wù)₩↕ ±源性食品中的(de)殘留可(kě)以通(tōng)過食物(wù)鏈傳遞給人(←↔‍rén)類，長(cháng)期攝入有(yǒu)緻畸胎、緻癌等副作(z∏αuò)用(yòng)。美(měi)國(guó)、日(rì)本和(hé)歐盟目前已全面規λ∑∞定禁止使用(yòng)呋喃類抗菌物(wù)質，在動物(∏★<∑wù)源性食品中呋喃類殘留物(wù)的(de)檢出εδ限為(wèi)不(bù)得(de)檢出。我國(guó)農(nóng)業(yè)部文(wén)件β‍♦₹(jiàn)農(nóng)牧發[200211号也(yě)¥↑↔規定動物(wù)源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的(de)檢出限為(wèi)不(bù)得(de)≤∞"檢出。

目前用(yòng)于檢測硝基呋喃類抗生(shēng)素代謝(xièδ★)物(wù)殘留的(de)方法主要(yào)有(yǒu)HPLC、LC&mdasα≈↔h;M/MS和(hé)酶聯免疫法(EUSA)等₽>。其中HPLC和(hé)LC—MS/MS靈敏度高(gā★≥≥o)、準确性好(hǎo)，常作(zuò)為(wèi₽‍✘≤)藥物(wù)殘留檢測的(de)确認方法，在我國(guó)LC—MS/MS技(jì)♠✘£術(shù)更是(shì)被作(zuò)為(wèi)此類藥物¥♣(wù)在動物(wù)源性食品中檢測的(de)國(guó)标法。然此<&φ 類方法對(duì)儀器(qì)和(hé)操作(zuò)ε$人(rén)員(yuán)要(yào)求都(dōu)較 $•‍高(gāo)，一(yī)個(gè)樣品檢測要(yào)幾百元，檢測時(shí)間(jiān)也(y♥₹ ↓ě)很(hěn)長(cháng)，不(bù)能(n ♠éng)

滿足現(xiàn)場(chǎng)抽檢的(de)需求和(hé)推廣應用(y™‌>♠òng)。ELISA技(jì)術(shù)以其快(kuài)速、靈γ£✘敏、特異性高(gāo)等特點已成為(wèi)目前藥品殘留檢測的(de)有(yǒu★φ)效方法之一(yī)。應用(yòng)酶聯免疫技(jì)術(shù)檢測硝基呋→≥δ™喃類抗生(shēng)素及其代謝(xiè)物(wù)殘

留近(jìn)幾年(nián)來(lái)取得(de)了(le)少(shǎo≥©♥)許成果，Chang C等采用(yòng)ELISA測定可(kě)食性動物(wù)組≥βε✘織中呋喃唑酮代謝(xiè)物(wù)，抑制(zhì)率(Ic )可(kě)達到(dào)0．91m ↓& g／L，回收率55．8％～99．6％；δ±★'蝦類中喃唑酮代謝(xiè)物(wù)殘留ELIS÷¥& A篩選方法。他(tā)們在酸性條件(jiàn)下(xià)利用(yòng)2一( ™π yī)硝基苯甲醛衍生(shēng)化(huà)，乙酸乙酯提取，正己烷去(qù)雜(z♣♥↕γá)質後進行(xíng)ELISA分(fēn)析。™π$其最低(dī)檢測限為(wèi)0．3tLg／kg，&♣₽向樣品中添加濃度為(wèi)0．5、1．0和(hé)3．01xg/kg₹€α$ 3個(gè)梯度标準品溶液時(shí)，平均回收2率範圍為(≤₩πwèi)90．7％～95．9％。目前，國(guó)外(w"αài)也(yě)已經開(kāi)發出檢測呋喃妥因等代謝(xiè)物(wù)的(de)ELI♥★ SA商品化(huà)試劑盒。但(dàn)其& 價格昂貴，價格均在4000元，盒以上(shàng)。國€¥ α(guó)産呋喃妥因殘留檢測試劑盒質量和 (hé)性能(néng)都(dōu)不(bù)夠穩÷≤₽₹定，市(shì)場(chǎng)化(huà)範圍qE4",。本‍☆✔研究拟采用(yòng)酶聯免疫一(yī)步分(fēn)析法，研制(zhì)®÷出可(kě)以在短(duǎn)時(shí)間(jiān)內©β§×(nèi)大(dà)量定量分(fēn)析檢測水(shuǐ)産、蜂蜜、畜禽等生(shēng)物(®±£wù)樣本中AHD的(de)試劑盒。

1 材料和(hé)方法

1.1 材料與儀器(qì)AHD等标準品(Sigma公司，純度>99％)；HRP購(gòuπΩ)自(zì)美(měi)國(guó)IDS公司；TECAN Geni±÷os Basic酶标儀；樣品稀釋工(gōng)作(zuò)液；ELIβ←λ'SA試劑(包被液、封閉液、酶标記物(wù)稀釋液、終止液、濃✘ ✘★縮洗滌液)；其它化(huà)學試劑均為(≥®δ‍wèi)國(guó)産分(fēn)析純。

1.2 方法

1.2.1 AHD抗血清效價的(de)測定呋喃妥因抗血清采購(gòu)自(z•∑™ì)美(měi)國(guó)IDS公司。采用(yòng)直接ELISA法進行(xíng →£✘)測定。酶标反應闆包被抗呋喃妥因抗血清、洗滌、封閉，Ω±φ并以同樣的(de)稀釋度的(de)陰性血清為(γδwèi)對(duì)照(zhào)，第1行(xíng)1～12孔依次•£↕✘加入倍比稀釋的(de)呋喃妥因過氧化(huà)合物(wù)酶結合物(w© β'ù)(購(gòu)自(zì)美(měi)國(guó)IDS公司∞ ±)，均為(wèi)IO0uL／孔，22～23℃溫育1∑✘↔∏0min；再加入辣根過氧化(huà)物(wù)酶(ARP)底物(wù)(π$購(gòu)自(zì)美(měi)國(guó)

IDS公司)lO01~ld孔，經過10min孵育，終止反應後測定OD₄₅₀值。抗血清的(de)OD₄₅₀值與相(xiàng)同稀釋度的(de)陰性血清0D₄₅₀值之比大(dà)于2的(de)最大(dà)稀釋度定為(wèi)呋喃σ✘妥因抗血清的(de)效價。

1.2.2 EUSA方法的(de)建立呋喃妥因抗血清的(de)效價确定之後，依次通(tōng)過對(σσ¶duì)半抑制(zhì)濃度(IC )值、最大(dà)吸₽★光(guāng)度值進行(xíng)比較确定最佳抗體(tǐ✔λ)包被濃度和(hé)酶标抗原工(gōng)作(zuò)濃¥✔∑度、包被條件(jiàn)、反應時(shí)間(jiān)、底物(wù)顯色時(shí)間(•'jiān)等。以AHD濃度( g／L)的(de)自(zì)然對(duì)數('Ω®shù)值為(wèi)x軸，百分(fēn)吸光(guāng)率B／BO(B為(wèi)添加藥物(€β‌wù)時(shí)的(de)吸光(guāng)值，B0為(wèi)不(bù)添加藥物( ✘ wù)時(shí)的(de)吸光(guāng)值)為(wèi)Y軸，繪制(zhì)曲線圖。

1.2.3 AHD标準曲線的(de)建立根據1.2.2節得(de)到(dào)的≈ ε(de)最佳ELISA方法條件(jiàn)，選擇合适的(de)抗原λ¶↔抗體(tǐ)含量及不(bù)同濃度梯度的(de)AHD标準品(O、0↔₽．05、0．15、0．45、1．35、4．0€>₹δ5ppb)進行(xíng)一(yī)步

法直接競争ELISA，以AHD标準品濃度(ng／mπ∏L)的(de)自(zì)然對(duì)數(shù)值為(wèi)x軸，百分(' 'δfēn)吸光(guāng)率B／B0為(wèi)±×≈↕Y軸，得(de)到(dào)線性及靈敏度較高(gāo)的(de)呋喃妥因标準曲線。

1.2.4 樣品前處理(lǐ)方法的(de)建立對(duì)于組織(肌肉、肝髒、水(shu‍™$>ǐ)産等)取适量供試樣用(yòng)均質器(qì)均質樣本，避免出現(xiàn)有(yǒu)→✔Ωσ高(gāo)脂肪、血管等物(wù)質，取1．0&pl ↕↔usmn;0．05g的(de)均質物(wù)進行£∞©(xíng)以下(xià)操作(zuò)；對(duì)于蜂蜜樣品直接稱取1．0±® O．05g的(de)供試樣進行(xíng)一(yī)下(xià)操作(zuò)：

(1)衍生(shēng)化(huà)

加人(rén)4mL蒸餾水(shuǐ)，0．5mL 1M 鹽酸和(h£®é)150 L 50mM的(de)4一(yī)硝基苯甲♣↕醛溶液；渦旋混勻30s，60％水(shuǐ)浴3h，每♦₹→隔1h渦旋振蕩一(yī)次。

(2)提取

加人(rén)5mL 0．1M 磷酸氫二鉀和(hé)0．4mL 1M氫氧化(hu ♦à)鈉溶液，混勻加入6mL乙酸乙酯，劇(jù)烈±≤Ω振蕩60s以上(shàng)；室溫條件(jiàn)下(xià π★®)，4000g離(lí)心10rain；收集3mL的(de)上↓×®(shàng)層乙酸乙酯至10mL玻璃試管(不(bù)能(néng)使用(‌&₩←yòng)塑料管)，50～60％水(shuǐ)浴氮氣吹幹。

(3)淨化(huà)

加人(rén)lmL正己烷，渦旋混勻30s，然後加入lmL樣品稀釋工(gōng)作(zuò)♦±液複溶，振蕩混勻30s(組織樣本此過程中一(yī)定要(yào)注意防止乳化¥€≥(huà))；室溫條件(jiàn)下(xià)3000g離(lí)心5min完全棄去(qù)上γ£←✔(shàng)層有(yǒu)機(jī)相(' σxiàng)，取下(xià)層水(shuǐ)相(xià∑> ♠ng)取50 L用(yòng)于分(fēn)析。對(duì)于飼料樣品，稱取1．0±'Ω‍∑0．05g粉碎的(de)樣本加入lOmL乙腈，65℃超聲波提取15min，室溫下(xià)400σλ•0rpm離(lí)心10min；取上(shàng)®"®≤清液2mL，于50～60％水(shuǐ)浴環境中氮氣吹幹→α§¥；加入lmL樣品稀釋工(gōng)作(zuò)液溶解幹燥物(wù)。充分(fēn)混勻後用βα'(yòng)樣品稀釋工(gōng)作(zuò)液再做(zuò)1O倍稀釋，取50 L用Ω←(yòng)于分(fēn)析。

1.2.5 試劑盒各項技(jì)術(shù)參數(shù)的(de)÷'∑确定

(1) 試劑盒靈敏度實驗

評價競争性酶聯免疫吸附實驗反應靈敏度的(d∏✘e)方法，常用(yòng)的(de)有(yǒu)Ic 和(hé)檢測δ§限(下(xià)限)。分(fēn)别測定20次标準曲線的(de ↑)Ic,确定該值的(de)浮動範圍。一(yī)定條件₽ ¥∞(jiàn)下(xià)，試劑盒方法檢測限符合

正态分(fēn)布的(de)規律，取肌肉、肝髒、水(shuǐ)産、蜂蜜20個(gè)空(kōβ☆∏ng)白(bái)樣本通(tōng)過試劑盒測定的(de)光(guāng)密度在标σ≠↓準曲線上(shàng)對(duì)應的(de)AHD含量的(de)↓ ×©平均值(x)和(hé)标準差(s)表示，檢測→ 限=X+3S。

(2) 試劑盒重複性和(hé)再珊I生(shēng)實驗

重複性即實驗室內(nèi)的(de)變異程度。以蜂蜜樣品為(wèi)例，将空(kō₹φ•ng)白(bái)樣品以定量限0．5 g／kg、兩倍定量限1 g／ γkg進行(xíng)添加，每個(gè)濃∞↕度各5個(gè)平行(xíng)，并抽取3批試劑盒，每批試&•§劑盒測定

同一(yī)份樣品3次，分(fēn)别計(jì)算(su☆←∑àn)測定樣品闆內(nèi)、批內(nèi)和(hé)批間(jiāδ€♥βn)平均回收率，得(de)到(dào)樣品的(de)變異系∞♠數(shù)和(hé)回收率範圍。再現(xiàn)性即實驗室間(jiān)的(de)變異程度。對( ✔ duì)同一(yī)魚肉樣品，分(fēn)别在不(bù)同地(₽α↕dì)點的(de)實驗室對(duì)随機(jī)抽取的(deεεδ)同一(yī)批次的(de)3個(gè)試劑盒進行(x© "íng)添加實驗，計(jì)算(suàn)其平均♥σ₩₩回收率和(hé)變異系數(shù)。

(3) 試劑盒特異性實驗

試劑盒的(de)特異性可(kě)用(yò♥♦γ€ng)藥物(wù)的(de)交叉反應率來(lái)表示。交叉反應率即引起50％抑制(zhì)的(d$♠♠☆e)标準物(wù)濃度與類似物(wù)引起5★ 0％抑制(zhì)的(de)濃度值之比。本實驗分(fēn)别測定了(le)該試劑盒與呋♦∏喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西(xī)林(lín)、呋喃妥因等原型藥及其代謝(xiè)物 '(wù)的(de)交叉反應率。

(4) 試劑盒穩定性實驗

采用(yòng)冷(lěng)熱(rè)性加速實驗确定試劑盒的÷λα(de)穩定性。将三批試劑盒置于37℃恒溫箱中1d、3d、6d，随機(↕&jī)取6盒試劑盒檢測相(xiàng)關技(jì)術(shù)>±ε指标。從(cóng)3批試劑盒中抽出6個(gè)試劑盒，每盒均做(§‌zuò)4℃ 6個(gè)時(shí)間(ji∑"ān)段(第0、1、2、3、6、7月(yuè))的(de)保存試驗。每個(g₩↕ è)時(shí)間(jiān)點分(fēn)别取出1個(gè)試劑盒，每×✘≈☆個(gè)試劑盒做(zuò)5條曲線、5個(g×φ¶è)樣品重複，測定其Ic 抑制(zhì)濃度(靈敏度)☆≥★、檢測限、标準品闆內(nèi)變

異系數(shù)和(hé)回收率等相(xiàng∞π‍¶)關技(jì)術(shù)指标。

2 結果

2.1 AHD抗血清效價的(de)确定經測定AHD抗血清的(de)效價為(wèi)1000。

2.2 AHD抗體(tǐ)包被濃度和(hé)酶标抗原工(gōng)作(zuò‌→)濃度的(de)确定通(tōng)過滴定法對(duì)Ic 值、最大(dà)吸光(guā®‌ng)度值和(hé)樣品添加回收率的(de)比較，‍♦"γ确定抗體(tǐ)的(de)包被濃度和(hé)酶¶ε标抗原的(de)工(gōng)作(zuò)濃度。

随著(zhe)包被抗AHD抗血清濃度的(de)降低(dī)，最大(±dà)吸光(guāng)值降低(dī)，Ic 值在一(yī)定範圍內(nè®§•i)也(yě)随之降低(dī)。經測定包被抗血清按1.50&timeα♦s;10 倍稀釋，其Ic 濃度、回收率和(hé)吸光(guāng)度值均較好(hǎo©$)。因此，選擇1.5 x 10 倍稀釋的(de)包被抗血清進行(xíng)£♦Ω包被。AHD酶标物(wù)在2.5×10 ‍✔©倍稀釋時(shí)，最大(dà)吸光(guāng)度值、IC 一(yī)直濃度和(h↑←¶é)樣品測定結果均處于最佳狀态。3.0 x 10，倍稀釋時(shí)，吸光(guāng)度降低(d♣✔✔ī)以及本底幹擾增加。所以酶标抗原濃度選擇以試驗研究2500•£&倍稀釋相(xiàng)對(duì)較好(hǎo)。

2.3 包被條件(jiàn)的(de)确定用(yòng)包被液将抗AHD抗血清稀釋至最适工(gōnσ↑g)作(zuò)濃度，每孔100It,L，分(fēn)成3組。第一(yī)組：37℃溫育π₩≠lh；第二組：37。c溫育2h；第三組：4℃溫育24h。綜合3組數(shùσ♥↕)據結果，選擇最大(dà)吸光(guāng)值較大(dà)，I≥✘'c 較低(dī)，添加回收率較高(gāo)的(de)包被條件(jiàn)作(zuòπ£ )為(wèi)試劑盒的(de)包被條件(jiàn)；37％溫育2h，最大(dà)吸光(guāng•&)值和(hé)IC 比較好(hǎo)，故選擇該包被條件(jiàn)。

2.4 反應時(shí)間(jiān)的(de)确定加入标準品溶液和(hé)酶标抗原溶液後分(fēn)另擁10min，30min，60min，結果見✔☆♦(jiàn)表5。樣品與酶枥就(jiù)原與抗血清反應時(shí)間(jiān)為(wè£∏i)30min後，樣品中的(de)AHD能(néng)充分(fēn)與酶标抗原競争結合酶标闆♦"₹上(shàng)的(de)已包被的(de)抗血清的(de)有(yǒu)效位點，再♦≈₩★加入底物(wù)顯色液，可(kě)以提高(gāo)反應的(de)靈敏度并且最大(dà)吸光(↔±×guāng)度值也(yě)比較好(hǎo)；而反應lOmin，加 ↑₩≈人(rén)底物(wù)顯色液，其吸光(guāng)值較低(dī)，易出現(xi¶♦®àn)樣品測定結果不(bù)準确現(xiàn)象；其次反應60≤βγmin，最大(dà)吸光(guāng)值偏高(gāo)。

2.5 底物(wù)顯色時(shí)間(jiān)的(de)确定加入底物(wù)溶液後，22 23％條件(jiàn)下(xi∏≈à)顯色5min、10min、20min。底物(wù)≈≈液顯色時(shí)間(jiān)若較短(duǎn)(5min)，則吸光(₽★×÷guāng)值較低(dī)，對(duì)加終止液的(de)時(shí)間(★β•₩jiān)要(yào)求更短(duǎn)，否則會(huì)出現(xiàn)實際值✘₹∏與真實值直接的(de)差異。20min，吸光(guāng)度值較高(g♥↕•āo)，對(duì)Ic 有(yǒu)輕微(wē♣&©i)影(yǐng)響，且增加了(le)整個(gè)操δ₹作(zuò)時(shí)間(jiān)。顯色10min，曲線和•✔(hé)實際樣品測定均符合要(yào)求。其吸光(guāng ♣♦)度值域Ic 值均較好(hǎo)，故選用(yòng)其作(zuò)為(wèi)試劑盒的(de)顯σ&♣$色反應時(shí)間(jiān)。

2.6 試劑盒的(de)組裝經反複實驗，成功組裝了(le)AHD一(yī)步法ELISA試劑盒，包括：酶标闆1塊(12條X÷≤σ£ 8孔，可(kě)拆分(fēn))；酶标物(wù)1瓶(濃縮液10 X：1．2♣±₹¥mL)；酶标物(wù)稀釋液1瓶(13mL)；樣品稀釋液5×1瓶(4€πOraL)；清洗液10 X l瓶(50mL)；顯色劑1瓶(13α≥πmL)；終止液1瓶(13mL)；AHD标準品6 x lmL/管∞>♣(Ong/mL，0.05ng/mL，0.15 ng/mL，0≠↑.45 ng/mL，1.35 ng/mL，4．05 ng♣"/mL)；4一(yī)硝基苯甲醛75.5mg。

2.7 試劑金(jīn)各項技(jì)術(shù)參數(shù)的(de)确定

2.7.1 試劑盒靈敏度的(de)确定統計(jì)Ic 二十次測定結果，β→ Ic₅₀ 平均值為(wèi)0.47ng/mL，浮動範圍在0.30—0.↔↔60ng/mL之間(jiān)。經試驗确定樣品中 'δ₩AHD代謝(xiè)物(wù)最低(dī)檢出限為(wèi)0．3ug☆≠/kg(組織樣品)；樣本中原型藥最低(dī)檢測限為(wèi)5Oug/kg(飼料)。該檢≈≠測限能(néng)滿足歐盟的(de)1ug/kg的(de)'₩最低(dī)檢測限量的(de)要(yào)求。

2.7.2 試劑盒重複性和(hé)再現(xiàn)性的(de)确定對(duì)蜂☆¶ π蜜樣1.0 ug/kg、2.0 ug/kg兩個(g>♠è)濃度的(de)AHD進行(xíng)添加，測定變異系數(shù↕≠€α)，樣品的(de)闆內(nèi)變異系數(s ↔hù)為(wèi)1.7％～9.86％之間(jiān)，♦♦≠批內(nèi)、批間(jiān)變異系數(shù)均小(xiǎo)于™☆15％，樣品的(de)平均回收率在65％一(yī)90％之間•¥¥(jiān)。對(duì)同一(yī)魚肉樣品，分(fēn)别在不(bù)同地(dì)點的(de)&<實驗室對(duì)随機(jī)抽取的(de)同一(yī)批次的(de)3個(gè)試劑盒進行 £™♥(xíng)添加實驗，計(jì)算(suà€<§←n)得(de)到(dào)的(de)加标平均 && 回收率分(fēn)别為(wèi)88％、76％和(hé)85％，闆問(wèn)、批內(nèi)↕β∏"和(hé)批間(jiān)變異系數(shù)均小(x₩∏¥iǎo)于15％，說(shuō)明(míng)此試劑盒再現(xiàn)α>性良好(hǎo)。

2.7.3 試劑盒特異性的(de)确定本試劑盒檢測結果顯示，AHD與其同類的(de)呋喃唑酮、呋♣∑喃它酮、呋喃西(xī)林(lín)等及其代謝(x♦$iè)物(wù)的(de)交叉反應率均小(xiǎo)于0♦¥¥γ．2％。表明(míng)該試劑盒适用(yòng)于食品中呋喃¥¶

妥因類藥物(wù)的(de)殘留檢測，具有(yǒu)良好(h§×ǎo)的(de)特異性。

2.7.4 試劑盒穩定性的(de)确定冷(lěng)熱(r≤"★<è)穩定性實驗結果顯示：該試劑盒在37℃經6d的(de)保存試驗，OD≥"★★值有(yǒu)所下(xià)降，但(dàn)零标準吸光(guāng)度值仍在1.0以上(shàng∑₩)。Ic 均在0.30～0.60ng/mL₩β‍ 之間(jiān)，陽

性回收率在67.7％一(yī)102.7％；标準品闆內(nèi)變異系數(shù)在↑↕•★15％以下(xià)。試劑盒保存條件(jiàn)為(wèi✔± )2—8℃ ，經過近(jìn)7個(g♠₽•è)月(yuè)的(de)測定，發現(xi‍σ×®àn)試劑盒從(cóng)生(shēng)産之起到(d♣' ào)第6個(gè)月(yuè)，各項指标≠'♥δ均符合《農(nóng)業(yè)部文(wén)件(jiàn€€)》農(nóng)醫(yī)發r[2oo >5] 17号附件(jiàn)2試劑盒備案參考評判标準的(✔₩β™de)規定。到(dào)第7個(gè)月(yuè)時(shí)檢測結果≥ 發現(xiàn)0标準吸光(guāng)度值在1.4左右，陽性樣品♣‌≥×回收率有(yǒu)下(xià)降趨勢但(dàn)幅度不(bù)是(shì) ∏π∏很(hěn)大(dà)。

3 討(tǎo)論

本研究針對(duì)呋喃妥因代謝(xiè)物(wù)(AHD)，依據一(yī)步法直接競争性E§☆ΩLISA原理(lǐ)，在組裝試劑盒時(s>λ♥hí)，采用(yòng)棋盤法确定最佳抗體(tǐ)包被濃度 ♠和(hé)酶标抗原工(gōng)作(zuò)濃度，選著(zhe)合适的(de)抗原$ ↑抗體(tǐ)反應緩沖液，從(cóng)而達到(dào)了(le)很(hěn)好(hǎoγ✘)的(de)競争抑制(zhì)效果。本研究建立了(le)肌肉、肝髒、水(shuǐ)産♣↓、蜂蜜等的(de)前處理(lǐ)方法，檢測限均遠(y'β λuǎn)低(dī)于lug/kg。線性檢測範圍為(wèi)0～4.05 ↕ ng／mL，IC₅₀平均值浮動範圍在0.30～0.60ng／mL之間( 'jiān)，樣品的(de)闆內(nèi)變異系數(shù)為(‌✔✔wèi)1．7％～9.86％之間(jiān)，批內(nèi)、批間♠™←(jiān)變異系數(shù)均小(xiǎo)于15％，樣品的©♥(de)平均回收率在65％～90％之間(jiān)，與其同類藥物(wù)的(∞© de)交叉反應率均小(xiǎo)于0.2％，重複性、再現(xiàn)性、特異性××、穩定性各項指标均符合要(yào)求。

綜上(shàng)所述，本研究建立的(de)呋喃妥因及其代謝(xiè)物(wù)直>λ∏接競争ELISA檢測試劑盒各項技(jì)術(shù)指标均符合要(yào)求≥π₹¥，本試劑盒操作(zuò)簡便、靈敏度高(gāo)、穩定性好(hǎo)、檢測時(£→→ shí)間(jiān)短(duǎn)，适用(yòng)★♥•于大(dà)量樣品中呋喃妥因殘留檢測的(de)快(kuài)速篩選，為(w ‌èi)食品中非法添加呋喃妥因造成的(de)食品安全問(wèn)題提供了(le♥±)可(kě)靠的(de)技(jì)術(shù)保障。

本文(wén)內(nèi)容摘自(zì)于“畜牧獸醫(yī↑₽)科(kē)技(jì)信息試驗研究”2012年(nián)≈✘Ω第7期