大(dà)腸菌群測定的(de)操作(zuò)細則
大(dà)腸菌群系指一(yī)群能(néng)發酵乳糖、産酸産氣、需氧和(hé)兼性厭(yàn)氧的(de)革蘭氏陰性無芽胞杆菌。該菌主要(yào)來(lái)于人(rén)畜糞便,故以此作(zuò)♣& 為(wèi)糞便污染指标來(lái)評價食品的(de)衛生(shēng)質量,推斷食品中有(yǒu)否污染腸道(dào)緻₹'病菌的(de)可(kě)能(néng)。 
食品中大(dà)腸菌群數(shù)系以100mL(g)檢樣內(nèi)大(dà)腸菌群最可(kě)能(néng)數(shù)(MPN)表示。 
1 設備和(hé)材料 
1.1 溫箱：36±1℃。 
1.2 冰箱:0～4℃。 
1.3 恒溫水(shuǐ)浴:44.5±0.5℃。 
1.4 天平。 
1.5 顯微(wēi)鏡。 
1.6 均質器(qì)或乳缽。 
1.7 平皿:直徑為(wèi)90mm。 
1.8 試管。 
1.9 吸管。 
1.10 廣口瓶或三角燒瓶:容量為(wèi)500mL。 
1.11 玻璃珠:直徑約5mm。 
1.12 載玻片。 
1.13 酒精燈。 
1.14 試管架。 
2 培養基和(hé)試劑 
2.1 乳糖膽鹽發酵管:按GB 4789.28中4.9規定。 
2.2 伊紅(hóng)美(měi)藍(lán)瓊脂平闆:按GB 4789.28中4.25規定。 
2.3 乳糖發酵管:按GB 4789.28中4.10規定。 
2.4 EC 肉湯:按GB 4789.28中4.11規定。 
2.5 磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB 4789.28中3.22規定。 
2.6 生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)。 
2.7 革蘭氏染色液:按GB 4789.28中2.2規定。★↔  
3 操作(zuò)步驟 
3.1 檢樣稀釋 
3.1.1 以無菌操作(zuò)将檢樣25mL(或g)放(fàng)于有(yǒu)225mL滅↑π♥菌生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)或其他(tā)稀釋液的(de)滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)予置适當數(shù)量的(de)玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經充分(fēn)振搖或研磨 ₩做(zuò)成1:10的(de)均勻稀釋液。固體(tǐ)檢樣最好(hǎo)用(yòng)均質器(qì),以8 000-10 000 r/min的(de)速度處理(lǐ)1min,做(zuò)成1:¶•λ'10的(de)均勻稀釋液。 
3.1.2 用(yòng)1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有(yǒu)9m←↓★→L滅菌生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)或其他(tā)稀釋液的(de)試管內(nèi),振搖試管混勻,做(zuò)成1:100的(de) ¥±稀釋液。 
3.1.3 另取1mL滅菌吸管,按上(shà♥φ←ng)條操作(zuò)依次做(zuò)10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋×φ ε一(yī)次,換用(yòng)1支1mL滅菌吸管。 
3.1.4 根據食品衛生(shēng)标準要(yào)求或對(duì)檢樣污染情況的(de)估計(jì),選擇三個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度,接種3管。 
3.2 乳糖發酵試驗 
将待檢樣品接種于乳糖 膽鹽發酵管內(nèi),接種量在1mL以上(shàng)者,用(yòng)雙料乳糖膽鹽發酵管,1mL及1mL以下(xià)者,用(yòng)單料乳糖膽鹽發酵管。每一(yī)稀釋度接種3管,置36±1℃ 溫箱內(nèi),培π€ 養24±2h,如(rú)所有(yǒu)乳糖膽→α鹽發酵管都(dōu)不(bù)産氣,則可(kě)報(bào)告為(wèi↓ ¥♥)大(dà)腸菌群陰性,如(rú)有(yǒu)産氣者,則按下(xià<↓)列程序進行(xíng)。 
3.3 分(fēn)離(lí)培養 
将産氣的(de)發酵管分(fēn)别轉種在伊紅(hóng)美(měi)藍(lán)瓊脂平闆上(shàng),置36±1℃ 溫箱內(nèi),培養18-24h,α•然後取出,觀察菌落形态,并做(zuò)革蘭氏染色和(hé)證實試驗。 
3.4 證實試驗 
在上(shàng)述平闆上(shàng),挑取可(kě)疑大(dà)腸菌群菌落1-2個(gè)進行(xíng)革蘭氏染色,同時(shí)接種乳糖發酵管,置 36±1℃溫箱內(nèi)培養24±2h,觀察産氣情Ω₹'∏況。凡乳糖管産氣、革蘭氏染色為(wèi)陰性的(de)無芽胞杆菌,即可(kě)報(bào)告為(wèi)大(dà)腸菌群陽性。 
3.5 報(bào)告 
根據證實為(wèi)大(dà)腸菌群陽性的(de)管數(shù),查​&↕MPN檢索表,報(bào)告每100mL(g)大(dà)腸菌群的₽& (de)MPN值。 
4 糞大(dà)腸菌群(faecal coliform) 
4.1 用(yòng)接種環将所有(yǒu)産氣的(de)乳糖膽鹽發酵管培養物(wù)(見(jiàn)3.2條)轉種于EC肉湯管內(nèi),置44.5±←¥0.2℃水(shuǐ)浴箱內(nèi)(水(shuǐ)浴箱內(nèi)的(de)水(sh ¥uǐ)面應高(gāo)于EC肉湯液面),培$≥養24±2h,經培養後,如(rú)所有(yǒu)  αEC肉湯管均不(bù)産氣,則可(kě)報(bào)告為(wèi)陰性;如(rú)有(₹σ©∏yǒu)産氣者,則将所有(yǒu)産氣的(de)EC肉湯管分(fēn)别轉種于∑♥§¶伊紅(hóng)美(měi)藍(lán)瓊脂平闆上(shàng),置 培養18-24h,凡平闆λ∑上(shàng)有(yǒu)典型菌落者,則證實為(wèi)糞大(dà)腸菌群陽性。 
4.2 結果報(bào)告 
根據證實為(wèi)糞大(dà)腸菌群的(de)陽性管數(shù),查MPN檢索表,報(bào)告每100mL(g)糞大(dà)σ∏≠腸菌群的(de)MPN值。